10游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定操作规程
公共场所游泳池水微生物检验记录
公共场所游泳池水微生物检验原始记录
样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：检验依据：
一、细菌总数测定：用灭菌吸管吸取均匀水样1mL，注入到灭菌平皿内，另取1mL注入到灭菌平皿内
作平行接种。
取1mL加到9mL无菌生理盐水作1:10稀释，混匀后取2mL分别加到两个平皿内，每皿1mL。
将融化并冷却45℃的营养琼脂培养基倾入平皿内，每皿约15mL，另取一个不加样品的平皿做空白对照。
立即旋摇平皿，使水样和培养基充分混匀。
待琼脂凝固后翻转平皿，置37℃恒温箱
计算及结果：细菌菌落总数（CFU/mL）:
注：⊕产酸产气；﹢产酸不产气或有可疑菌落；﹣不产酸不产气或无可疑菌落；G-b革兰氏阴性杆菌；G+b革兰氏阳性杆菌；G+c革兰氏阳性球菌。
结果：根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，得MPN/L。
膜滤法
培养箱编号：使用状况试验前：试验后：
检测人：校核人：审核人：
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食品卫生微生物学检验大肠菌群检查操作程序
大肠菌群检验标准操作程序1 大肠菌群1.1 试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/L NaOH、无菌1mol/LHCL1.2 仪器：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、显微镜、均质器或灭菌乳钵、架盘药物天平、灭菌吸管1ml、10ml、灭菌锥形瓶、灭菌玻璃珠、灭菌培养皿、灭菌试管、灭菌刀、剪子、镊子1.32 操作：2.1 样品的稀释2.1.1 固体和半固体样品：以称取25g样品，放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min的均质1-2min，或放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2分钟，做成1：10的均匀稀释液。
2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
2.1.3 样品匀液的PH值应不6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/LHCL 调节。
2.1.4 用1ml灭菌吸管或微量移液管理吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入注入9ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
2.1.5 根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀淮。
每递增稀释1次，换用一支1ml无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15分钟。
2.2 初发酵试验2.2.1 每个样品，选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
微生物实验10水中大肠菌群数的测定
实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。
3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。
如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。
2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。
3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。
大肠菌群测定操作规程
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大肠菌群测定操作规程
适用范围：大肠菌群系指一群在 36℃条件下培养 48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。通常用此法作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。
二． 1.
操作内容： 检验程序： 检样→ 稀释 → LST 发酵管（36±1℃，24±2h）
↓→不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 →BGLG（36±1℃，48±2h） → 不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 → 大肠菌群阳性 → 报告 2. 操作方法：
2.1 以无菌操作，将检样 10ml 被测液放于含有 90ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶 内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。 2.2 用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液） ，振摇试管，混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （均 液的 PH 值应在 6.5～７.5 之间，必要时分别用 1mol/L 氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL） 调节。 2.3 另取 1ml 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。 2.4 根据食品卫生标准要求或对检污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。 2.5 初发酵试验：将待检样品接种于月桂基硫盐胰蛋白胨发酵管内，接种量在 1ml，每一稀释度接种 3 管， 36±1℃文箱内培养 24±2h， 置 观察倒管内是否有气泡产生， 如未产气则继续培养至 48h±2h. 记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 2.6 复发酵试验 用按种环从所有 48h±2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环， 移种于 BGLB 肉汤管中， 36±1℃培养 48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.8 报告： 根据证实为大肠菌群阳性的管数， MPN 检索表 查 （见 GB/T4789.3 附表 B） 报告每 100ml ， （g） 大肠菌群的 MPN 值。
09游泳池水微生物检验方法细菌总数测定操作规程
1、目的：游泳池水微生物检验方法细菌总数测定。
2、适用范围：本标准适用于游泳池水细菌总数的测定。
3、责任：使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容4.1定义细菌总数：指水样在一定条件下培养后（如培养基成分和PH值、培养温度和时间以及需氧性质等），1ml检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧菌落总数。
细菌总数可作为判定游泳池水被污染程度的标志，也可以为游泳池水消毒效果的判定和评价提供依据。
4.2仪器三角瓶。
量筒。
PH计或精密PH试纸。
高压消毒锅。
试管。
灭菌平皿：直径9cm。
灭菌刻度吸管：1mL、2ml、10mL。
酒精灯。
恒温培养箱。
放大镜。
4.3培养基和试剂4.3.1营养琼脂培养基4.3.1.1成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g氯化钠 5g琼脂 15～20g蒸馏水 1000ml4.3.1.2制法：将上述各成分混合，加热溶解，校正pH至7.4，过滤分装，121℃20分钟高压灭菌，用自然沉降法测定时，倾注约15ml，于灭菌平皿内，制成营养琼脂平板。
用撞击法测定时，则参照采样器采样使用说明制备营养琼脂平板。
4.3.2 10%（m/m）硫代硫酸钠溶液，121℃高压灭菌20min。
4.5 操作步骤4.5.1 采样瓶的要求和预处理：用于微生物分析的采样瓶要无酸、无碱、无毒的玻璃容器。
采样瓶在灭菌前加入足量的10%（m/m）硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液.一般情况下125ml的采样瓶加0.1ml，加完后121℃高压灭菌20min。
4.5.2 用灭菌吸管吸取均匀水样1ml，注入到灭菌平皿内，另取1ml注入另一灭菌平皿内作平行接种。
取1ml加到9ml无菌生理盐水中作1：:10稀释，混匀后取2ml分别加到两个无菌平皿内，每皿1ml。
4.5.3 将溶化并冷却至45℃的营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另取一个不加样品的平皿作空白对照。
大肠菌群的测定方法操作规程
大肠菌群的测定方法操作规程1 培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，煌绿乳糖胆盐肉汤，结晶紫中性红胆盐琼脂，无菌生理盐水2操作步骤2.1样品的稀释：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1支 1 mL 无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
2.2选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。
同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.3及时将15 mL～20 mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36℃±1℃培养24h～48 h。
3平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。
4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃培养48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
5大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4.4中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中一、任务目标1.会画出停车场出入口管理系统的系统结构图和系统布线图；2.了解停车场出入口管理系统中各设备的参数、性能指标、工作原理；3.掌握停车场出入口管理系统中各设备的安装、调试和应用方法。
水的微生物检验
水的微生物检验一、器材：1 •培养基：PCA、灭菌双料5支、单料10支/每个样品（乳糖蛋白胨）2．仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶（带塞）且加入稳定剂，灭菌培养皿、灭菌吸管、灭菌镊子、灭菌棉球、灭菌10 ml 生理盐水（灭菌9 ml 生理盐水）、酒精灯（打火机、酒精棉球）、样品筐二、水样的采集：1 • 用灭菌棉球将水龙头擦干（钢铁管口用酒精灯烧灼消毒水龙头周围 3 分钟）2. 完全打开水龙头使水流2-5分钟后，将水龙头关小，以灭菌三角烧瓶接取水样。
方法二：1. 流1-2分钟2. 关上，擦水龙头四周3. 打开水龙头，流2-5 分钟4. 接水注意：1.加硫代硫酸钠的量：500 ml水加1.5%硫代硫酸钠2ml或每500 ml加0.4ml硫代硫酸钠。
2. 样品瓶必须专瓶专用，灭菌后须干燥。
3. 人手和手套不得与样品瓶内壁或瓶塞接触。
4. 采样记录用胶纸粘贴或悬挂标签于水样瓶上，注明水样编号、采样者、日期、时间及地点等。
5. 运送水样应避免瓶摇动（充满容器并密封，除冷冻样品），以免水样溢出后又回流瓶中增加污染。
6. 取样后2 小时内检验，冷藏4小时内检验7. 做样在无菌间做。
三、细菌总数、大肠菌群测法参照GB5750-85 （2001 版）水的余氯检测程序一、器材：配好的比色管10 支，洁净的50ml 比色管1 支，三角锥瓶2个（带塞）二、水样采集：打开水龙头流水1-2 分钟后，以三角烧瓶接取水样，涮洗3 次，接取200ml 左右，迅速送到实验室比色。
三、操作：准确吸取2.5ml 邻联甲苯胺溶液于50ml 比色管中，加水样至50ml 刻度处。
当接近刻度时，改用滴管加至刻度处，以与眼平行时，凹液面与刻度相平为准。
（盖上瓶塞，颠倒混匀2-3 次），迅速比色，然后审核并做记录。
四、注意事项：1. 抽取时间：车间上班30 分钟后。
2. 每天三角锥瓶、比色管用完后刷洗并控干。
3. 5ml 吸管每月换1（或2）支。
4. 抽取按编号顺序抽取。
游泳池水 大肠菌群的测定原始记录
操作步骤 品红硫酸钠琼脂 革兰氏染色、镜检 乳糖蛋白胨培养基
操作步骤
三倍浓缩乳糖胆盐培养液 EMB 平板典型菌落生长
革兰氏染色镜检 乳糖复发酵实验
操作步骤 品红硫酸钠琼脂 革兰氏染色镜检 乳糖蛋白胨培养基
游泳池水 大肠菌群的测定原始记录（续表）
样品接种量（“＋”阳性；“－”阴性。G+ 革兰氏阳性；G- 革兰氏阴性）
]
样品编号
1、向 2 个装有 50mL 三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯加入水样 100mL； 2、向 10 支装有 5mL 三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管加入水样 10mL；3、 一、多管发酵法
轻摇试管，使液体充分混匀，置 36℃±1℃培养箱，培养 24h；4、观察是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若产气为试验阳性，需进一步证实试验。
空白对照
复核：
样品 1
样品 2
平均菌落数
日期：
年
月 日颁布
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报告结果 MPN/1000mL
月日
平板分离 在阳性管中取一环接种到伊红美蓝琼脂平板上，置 36℃±1℃培养箱培养 18-24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落 1-2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于 36℃±1℃培养箱中，培养 24h。
操作步骤
培养条件
100mL×2
100mL×2
10mL×10
年
第
空白对照
样品 1
样品 2
平均菌落数
100mL×2
样品接种量（“＋”阳性；“－”阴性。G+ 革兰氏阳性；G- 革兰氏阴性） 10mL×10
大肠菌群测定的操作细则汇总
大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1）录入时间:2010-9-25 11:17:29 来源：生物信息网（一)实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二)实验原理水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。
这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
水中大肠杆菌数检验SOP
水中微生物学检验－大肠菌群检验操作规程1 目的本SOP用于水中大肠菌群的检测。
2 适用范围本SOP适用于水中大肠菌群的检测。
3 职责进行该项检验的检验员必须按本SOP进行检验，检测科科长负责监督本SOP 的正确执行。
4 检验4.1 技术依据及原理根据大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在370C24ｈ内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。
4.2 注意事项4.2.1 整个操作过程应在无菌环境中，按无菌操作技术进行。
4.2.2 操作中所用玻璃器皿均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽灭菌121℃20min，烘干备用。
4.3 材料、仪器、试剂的准备及基本要求4.3.1 乳糖胆盐发酵管：按GB/T4789.28-2003中4.9中规定。
蛋白胨5g猪胆盐 5g乳糖 10g0.04%湨甲酚紫溶液 25ml蒸馏水 1000ml4.3.2 伊红美蓝琼脂平板：按GB/T4789.28-2003中4.25规定。
蛋白胨10g牛肉膏 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 17g2%伊红美蓝溶液 20ml0.65%美蓝溶液 10ml蒸馏水 1000mlPH7.14.3.3 乳糖发酵管：按GB/T4789-2003中4.10规定。
蛋白胨20g乳糖 10g0.04%湨甲酚紫溶液 25ml蒸馏水 1000mlPH7.44.3.4 EC肉汤：按GB/T4789.28-2003中4.11规定。
胰蛋白胨 20g3号胆盐 1.5g乳糖 5g磷酸氢二钾 4g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000ml4.3.5 磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.28-2003中3.22规定。
4.3.6 0.85%灭菌生理盐水。
4.3.7 革兰氏染色液：按GB/T4789.28-2003中202规定。
4.3.7.1 结晶紫染色液：结晶紫 1g95%乙醇 20ml1%草酸铵水溶液 80ml将结晶紫溶液乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
水的微生物检验
水的微生物检验一、器材：1．培养基：PCA、灭菌双料5支、单料10支/每个样品（乳糖蛋白胨）2．仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶（带塞）且加入稳定剂，灭菌培养皿、灭菌吸管、灭菌镊子、灭菌棉球、灭菌10 ml生理盐水（灭菌9 ml生理盐水）、酒精灯（打火机、酒精棉球）、样品筐二、水样的采集：1．用灭菌棉球将水龙头擦干（钢铁管口用酒精灯烧灼消毒水龙头周围3分钟）2．完全打开水龙头使水流2-5分钟后，将水龙头关小，以灭菌三角烧瓶接取水样。
方法二：1．流1-2分钟2．关上，擦水龙头四周3．打开水龙头，流2-5分钟4．接水注意：1．加硫代硫酸钠的量：500 ml水加1.5％硫代硫酸钠2ml或每500 ml加0.4ml硫代硫酸钠。
2.样品瓶必须专瓶专用，灭菌后须干燥。
3.人手和手套不得与样品瓶内壁或瓶塞接触。
4.采样记录用胶纸粘贴或悬挂标签于水样瓶上，注明水样编号、采样者、日期、时间及地点等。
5.运送水样应避免瓶摇动（充满容器并密封，除冷冻样品），以免水样溢出后又回流瓶中增加污染。
6.取样后2小时内检验，冷藏4小时内检验7.做样在无菌间做。
三、细菌总数、大肠菌群测法参照GB5750-85（2001版）水的余氯检测程序一、器材：配好的比色管10支，洁净的50ml比色管1支，三角锥瓶2个(带塞)二、水样采集：打开水龙头流水1-2分钟后，以三角烧瓶接取水样，涮洗3次，接取200ml左右，迅速送到实验室比色。
三、操作：准确吸取2.5ml邻联甲苯胺溶液于50ml比色管中，加水样至50ml刻度处。
当接近刻度时，改用滴管加至刻度处，以与眼平行时，凹液面与刻度相平为准。
(盖上瓶塞，颠倒混匀2-3次)，迅速比色，然后审核并做记录。
四、注意事项：1.抽取时间：车间上班30分钟后。
2.每天三角锥瓶、比色管用完后刷洗并控干。
3.5ml吸管每月换1(或2)支。
4.抽取按编号顺序抽取。
5.比色管每半年换一次。
抽样程序一、器材：灭菌镊子8把（2把备用），抽样塑料袋6个，筐1个，记号笔，标签二、抽取方法：1.更衣及洗手消毒参照SSOP。
大肠菌群测试片操作流程
大肠菌群测试片检测操作流程1.样品的前处理:(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠杆菌标准菌：挑取平板上大肠杆菌标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液需用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（3）大肠菌群标准菌的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1 min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
水的微生物限度检查标准操作规程
1. 主题内容为了保证水的微生物限度检查法的正确操作，特制订本文件。
2. 适用范围适用于水的微生物限度检查法的操作。
3.责任本文件由QC负责起草，QC主管负责审核，质量部长负责批准。
QC人员负责本文件的执行。
4.内容4.1.简述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一。
4.2. 设备要求4.2.1. 微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统，应在洁净度100级的单向流空气区域内进行，其环境的洁净度为10000级。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
4.2.2.阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。
4.3. 取样4.3.1. 在各取水口用已灭菌好的封闭的250ml 空三角瓶取水，并将瓶子做上标记或贴上标签，标明日期和取样点名称。
4.3.2. 取样前洗手并消毒。
4.3.3. 将取样阀消毒。
4.3.4. 打开阀门，放水3~5分钟。
4.3.5. 已灭菌好的封闭的空三角瓶在取水前用75％的酒精棉球擦拭外壁。
4.3.6. 用待检测的水淋洗检验用取样瓶和瓶塞3次，每取样点取2瓶,共约1000ml.4.3.7. 微生物检验应在取样后的1h内，进行，否则将样品冷藏并在4h内进行检验。
4.3.8. 待检验的水在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。
包装已开启的样品不得作为供试品。
4.4. 试验准备4.4.1.将供试品及所有已灭菌的玻璃器皿经传递窗移至无菌室内。
编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
4.4.2. 开启紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。
再用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
水体中大肠菌群的检测步骤
水体中大肠菌群的检测步骤试验原理所谓大肠菌群，是指在37℃培育24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。
主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常状况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。
这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。
因而对饮用水必需进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简洁、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。
材料与器皿()培育基1、一般乳糖蛋白胨培育液蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。
2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液按上述一般乳糖蛋白胨培育液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。
3、品红亚硫酸钠培育基(供平板分别用)蛋白胨 10g，乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15-20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5%的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH7.2~7.4。
4、伊红美蓝培育基(EMB培育基)(供发酵法平板分别用，3和4可任选一种)蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2%伊红(曙红)水溶液 20mL，5%美蓝(亚甲蓝)水溶液13mL，pH7.2~7.4。
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程1.目的本标准操作规程的目的是为了能够准确、快速地测定食品中大肠菌群的数量，以便于对食品的卫生状况进行评估。
2.应用范围该操作规程适用于各种食品样品，如肉、鱼、蔬菜、水果等。
3.实验器材和试剂3.1器材：(1)无纤维纸滤纸或滤膜或滤布等过滤介质。
(2)LED 灯或紫外灯。
(3)培养皿、移液器、无毒胶带和显微镜。
(4)电子天平。
(5)水槽和蒸馏水。
3.2试剂：(1)胆盐琼脂培养基。
(2)大肠埃希菌ANTISERUM(可以根据需要添加，如：O157等)。
(3)含有氯化钠、肉汤和酚红的PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基。
4.操作流程4.1样品的准备样品应当是新鲜的、无病变的，如为肉类样品则需要去除肉骨、制成均匀的细碎物；如为水果蔬菜，则需将其冲洗干净削皮去籽核、制成较小的碎片。
如果是液体样品，需要摇匀，取少量样品进行分析。
(1)将胆盐琼脂培养基先膜切成适当的大小，放置在无菌的培养皿中，静置至凝固(温度约35℃)后，置于4℃左右冷藏备用。
(2)PB培养基的制备：每升PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基中加入10克肉汤粉和0.01克酚红，用蒸馏水充分搅拌均匀，灭菌后置于4℃左右。
4.3分析程序(1)取样品约10g，加入90mLPB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)中，用搅拌器搅拌1分钟，摇匀后放置2分钟(2分钟后即是样品液体)。
(2)取上述处理好的样品液1mL，加入9mL的PBS(NaCl、pH7.2±0.2)中均匀悬浮。
去除上清后再次悬浮，充分均匀。
(3)取上述悬浮液，利用无菌的吸管分别在胆盐琼脂培养基上均匀涂布(充分在滤纸上滤过)，然后进行相应的实验测定：a.在培养皿边缘涂上大肠埃希菌ANTISERUM(注意稀释)。
b.在光照充足的环境下，在37℃下培养16-18小时。
2024年游泳池水标准检验方法
2024年游泳池水标准检验方法
咱先得知道为啥要检验游泳池水呢？这游泳池水要是不干净，咱在里面扑腾可就不是享受而是遭罪啦。
可能会染上各种病，那可就糟心透了。
对于2024年的检验，微生物指标肯定是重点。
就像检测细菌总数，这就像是在池水里找那些看不见的小捣蛋鬼。
检验人员会用专门的培养基，把池水里的细菌培养出来，然后数个数。
要是细菌太多，那这池水可就不合格啦。
还有大肠菌群，这可是判断池水有没有被粪便污染的重要指标呢。
如果大肠菌群超标，想想都觉得恶心，就好像有人在池子里干了坏事一样。
除了微生物，化学指标也很关键。
pH值是必须要查的。
这pH值就像池水的脾气，如果太酸或者太碱，咱的皮肤和眼睛可受不了。
pH值在7.2 - 7.8之间是比较合适的，就像给池水找到了最舒服的状态。
还有余氯，这余氯就像泳池的小卫士，它能杀菌消毒。
但是余氯也不能太多，太多了就像刺鼻的消毒剂直接往鼻子里灌，太少又杀不了菌。
再说透明度的检验。
咱一眼望下去，要是池水浑浊得像浆糊，那肯定不行。
检验人员可能会用专门的透明度盘，往水里一放，看能看到多深。
如果只能看到一点点，那这池水就跟个大泥潭似的，游起来都没心情。
水温也不能忽视哦。
太凉了，像掉进冰窟窿，太热了又像在煮饺子。
合适的水温能让咱在泳池里像条快乐的小鱼。
检验水温就是用温度计简单一测，但是这个温度必须得在大家都能接受的范围里。
10游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定操作规程
1、目的依据GB/T18204.10—2000游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。
2、适用范围本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。
3、责任使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容：4.1定义：大肠菌群指一群在36℃±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
第一法多管发酵法4.2 仪器：高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
冰箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿：直径9cm.灭菌刻度吸管：1mL,10mL灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
放大镜。
PH计或精密PH试纸。
4.3 培养基和试剂：4.3.1乳糖胆盐发酵培养液4.3.1.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%（v/v）溴甲酚紫乙醇溶液1ml蒸馏水1000ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
4.3.1.2制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH 值至7.2～7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有带有倒管的试管中，在115℃高压灭菌15分钟。
4.3.2伊红美兰琼脂4.3.2.1成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂17g2%伊红水溶液20ml0.65%美蓝溶液10ml蒸馏水1000ml4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。
121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。
4.3.3革兰氏染色液4.3.3.1结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20ml1%草酸铵水溶液80ml将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.3.3.2革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
09游泳池水微生物检验方法细菌总数测定操作规程
1、目的：游泳池水微生物检验方法细菌总数测定。
2、适用范围：本标准适用于游泳池水细菌总数的测定。
3、责任：使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容4.1定义细菌总数：指水样在一定条件下培养后（如培养基成分和PH值、培养温度和时间以及需氧性质等），1ml检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧菌落总数。
细菌总数可作为判定游泳池水被污染程度的标志，也可以为游泳池水消毒效果的判定和评价提供依据。
4.2仪器三角瓶。
量筒。
PH计或精密PH试纸。
高压消毒锅。
试管。
灭菌平皿：直径9cm。
灭菌刻度吸管：1mL、2ml、10mL。
酒精灯。
恒温培养箱。
放大镜。
4.3培养基和试剂4.3.1营养琼脂培养基4.3.1.1成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g氯化钠 5g琼脂 15～20g蒸馏水 1000ml4.3.1.2制法：将上述各成分混合，加热溶解，校正pH至7.4，过滤分装，121℃20分钟高压灭菌，用自然沉降法测定时，倾注约15ml，于灭菌平皿内，制成营养琼脂平板。
用撞击法测定时，则参照采样器采样使用说明制备营养琼脂平板。
4.3.2 10%（m/m）硫代硫酸钠溶液，121℃高压灭菌20min。
4.5 操作步骤4.5.1 采样瓶的要求和预处理：用于微生物分析的采样瓶要无酸、无碱、无毒的玻璃容器。
采样瓶在灭菌前加入足量的10%（m/m）硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液.一般情况下125ml的采样瓶加0.1ml，加完后121℃高压灭菌20min。
4.5.2 用灭菌吸管吸取均匀水样1ml，注入到灭菌平皿内，另取1ml注入另一灭菌平皿内作平行接种。
取1ml加到9ml无菌生理盐水中作1：:10稀释，混匀后取2ml分别加到两个无菌平皿内，每皿1ml。
4.5.3 将溶化并冷却至45℃的营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另取一个不加样品的平皿作空白对照。
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1、目的
依据GB/T18204.10—2000游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。
2、适用范围
本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。
3、责任
使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容：
4.1定义：大肠菌群
指一群在36℃±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
第一法多管发酵法
4.2 仪器：
高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
冰箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿：直径9cm.
灭菌刻度吸管：1mL,10mL
灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
放大镜。
PH计或精密PH试纸。
4.3 培养基和试剂：
4.3.1乳糖胆盐发酵培养液
4.3.1.1成分：蛋白胨20g
牛肉膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6%（v/v）溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水1000ml
三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
4.3.1.2制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH 值至7.2～7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有带有倒管的试管中，在115℃高压灭菌15分钟。
4.3.2伊红美兰琼脂
4.3.2.1成分：蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂17g
2%伊红水溶液20ml
0.65%美蓝溶液10ml
蒸馏水1000ml
4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。
121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。
4.3.3革兰氏染色液
4.3.3.1结晶紫染色液：
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.3.3.2革兰氏碘液：
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
4.3.3.3脱色液：95%乙醇
4.3.3.4沙黄复染液：
沙黄0.25g
95%乙醇10ml
蒸馏水90ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.3.4染色法
4.3.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗。
4.3.4.2滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗。
4.3.4.3滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗。
4.3.4.4滴加复染液，复染1分钟，水洗，待干，镜检。
4.3.5染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
4.4 推测性试验
4.4.1在两个装有50ml三倍浓缩乳糖胆碱培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。
4.4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆碱培养液的试管里各加入水样10ml。
4.4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36℃±1℃培养箱中，培养24h。
4.4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。
4.5 证实试验
4.5.1 平板分离
自推测性阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美兰琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱
培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
4.5.2 复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36℃±1℃培养箱中，培养24h。
4.5.3 凡乳糖发酵管最终产酸、产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。
记下证实试验的阳性管数，查总大肠菌群（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
表1 总大肠菌群（MPN）检索表
第二法滤膜法
4.5仪器
滤器
滤膜：孔径0.45um。
直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和47mm两种。
抽滤设备
无菌镊子。
高压蒸汽灭菌器。
培养箱：36℃±1℃。
灭菌刻度吸管
冰箱
4.6 培养基
4.6.1品红亚硫酸钠培养基
4.6.1.1成分：蛋白胨10g
酵母浸膏5g
牛肉膏5g
乳糖10g
琼脂10～20g
磷酸氢二钾 3.5g
5%（碱性品红乙醇溶液20ml
蒸馏水1000ml
4.6.1.2储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值至7.2～7.4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000ml，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。
4.6.1.3 平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基1:50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。
再按1:200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪成淡粉色为止。
将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。
此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
4.6.2乳糖蛋白胨培养液
同4.3.1.
4.7 操作步骤
4.7.1 滤膜灭菌：将滤膜放入含有蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。
前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
4.7.2 滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精灯棉球火焰灭菌。
4.7.3水样过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在滤床上。
固定好滤器，将100ml水样（如水样含菌量较多，可减少滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在-0.5×105Pa（-0.5大气压）下抽滤。
4.7.4培养：水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。
用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。
然后将平皿倒置，放入36℃±1℃培养箱内培养18～24h。
4.7.5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落；
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色，中心色较深的菌落。
4.7.6将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于36℃±1℃培养48 h。
产酸产气者证实为大肠菌群阳性。
4.8 结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000ml水样中的大肠菌群数。