第九章体外单倍体诱导和单倍体育种

低温预处理的作用机理，学者们提出以下
几点：
1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了 小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向即纺锤体的 取向（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒）， 由于细胞分裂面的改变，花粉粒的极性分化不起作用， 因而形成两个均等的细胞，这种均等的细胞分裂使花 粉朝着形成胚胎的方向发育，进而形成愈伤组织或胚 状体。
9 柱头 花药 6 8 花柱 4 花瓣 （花冠） 3 花萼 7 子房 2 花托 1 花柄
雄蕊
花丝 5
雌 蕊
花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的
一部分，就培养方法和技术来讲，属于器
官培养的范畴。

花粉培养的精确定义是：将处于一定发育 阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离 体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养

胚状体再生特点
1、两极性，在其发生的最早阶段就具有根端和 芽端； 2、与外植体的维管束无直接联系，具有完整植 株的特点，在适宜的条件下可长成一个独立的
芽端和根端的植物。
三、花药培养方法

首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是
印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。目前
为避免花蕾失水，可将花蕾置于内装有浸湿的滤纸的培 养皿中，进行处理。 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是 十分必要的。 3、材料消毒
消毒方法与其它组织消毒同。
ห้องสมุดไป่ตู้、培养
1）、基本培养基
因植物不同，所适应基本培养基不同，MS、N6、B5
都有用。
2）、蔗糖浓度
很好的碳源 调节培养基渗透压
培养基中添加蔗糖浓度，尤其早期培养，浓度比其它 组织培养高，一般5%-10%。
分离方法： 1）自然释放法：将花药接种于液体培养基中，使花粉 自然释放。
2）人工挤压法：用玻璃棒捣碎花药，使花粉释放。
3）机械法：用磁力搅拌器打碎花药，释放花粉。 以上3种方法释放的花粉粒→ 尼龙网（孔径20-60 μm） 过滤，除去药壁等组织 → 离心收集花粉。
2、培养方式
一般以液体培养，调至密度104－105/ml ↓ 形成愈伤组织或胚状体，转入固体培养基
再生植株有可能来自药壁(2n)、药隔(2n)、或起
源于数个花粉(n)的嵌合体。
而游离花粉粒培养，再生植株为纯合体。 材料的选择、预处理、消毒、培养基以及再生 植株的染色体加倍等与花药培养基本相同。
不同之处：花粉分离收集、及培养方式
1、花粉分离收集
由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、
收集才能进行培养。
用含1-2％DMSO的秋水仙素浸泡分蘖节。 6、驯化移栽（与前同)
日傍晚点滴生长点数滴，进行5-6天；对于单子叶植物，
一、花粉培养定义

花粉培养(pollen culture)的精确定义是指把 花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作 为外植体进行离体培养技术。
二、花粉培养方法
游离花粉粒培养方法
花药有药壁(2n)、药隔(2n)、花粉(n)等，因此，
思考 题

通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？ 花药和花粉培养中为什么要对材料进行预处理？ 其原理是什么？
不同基因型（即不同植物或品种），培养最适宜的花 粉发育时期稍有差别，一般以四分子期至单核期最适 宜。
2、基因型
基因型不同，其培养的难易以及植株再生有很大差别。
3、花粉发育过程中环境条件的影响
花粉在母体上发育过程中光周期、光照强度、温度 等对以后的花粉离体培养有很大影响。
4、预处理
花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导频 率极低，采用低温、高温、化学试剂等预处理方法 可以促进花粉启动，提高再生频率。
第二节 花粉和花药培养

花药培养

花粉培养
一、花药培养定义

花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部
分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的
范畴。花药培养不需要进行游离花粉的处理，
也不需要特殊的培养方法，因而比花粉培养方
便快捷，是单倍体培养的主要手段。
二、花药培养再生途径
再生途径有两种：
（1）器官再生型：花粉粒经过均等分裂或不均等分
裂，形成多细胞花粉粒，突破花粉壁，形成松散的
不规则的细胞团即形成愈伤组织，再由其上再生植 株，如甘蓝、番茄、水稻等。 （2）胚状体再生型：花粉粒经过均等分裂或不均等 分裂，形成多细胞花粉粒，突破花粉壁，形成胚状 体，发育成单倍体植株，如曼陀罗、烟草等。 特点：数量多、速度快、结构完整、再生率高。
最早的花药培养再生花粉植株是经过胚状体 途径形成的。
组织及时转移到固体培养基上。
花药培养的目的是花药内花粉的植株再生，即 单倍体再生。因此，可将花药培养数日后，取 出其中花粉再培养。
5、单倍体确定及染色体加倍 单倍体确定方法，可以镜检根尖染色体数。 染色体加倍，用秋水仙素处理。可在培养阶段处理，
也可在驯化后移栽后处理。
培养阶段，培养基中加入50-250mg/L秋水仙素。 移栽后，用0.2%秋水仙素浸泡生长点1-3天，或每
第三节 材料的预处理

目的和作用：对材料进行适当的预处理有利于
花粉诱导。常用的预处理方法有低温处理、离
心、激光照射、乙烯利预处理。

1、低温处理
低温能明显提高花粉胚的诱导率。不同材
料采用的低温处理温度和时间有一定差异。 注意：低温处理时材料应保持较高的湿度，防 止材料失水，否则得不到预期的处理效果。
供试材料的遗传背景；供试材料的生理状 态；花粉的发育时期
选择花粉发育适宜时期（一般四分子期－单 核期）的花蕾。 镜检花粉发育时期，并根据发育时期与花蕾 大小、外观形态和颜色等的相关性，选择适 宜的花蕾。
2、材料预处理 取花粉发育适宜的花蕾进行预处理，低温处理一般在3-
5℃处理3-10天，高温处理一般在35℃处理1-3天。
3）、激素 激素种类和浓度对花药、花粉培养起着重要作 用，并且因植物不同而不同。
生长素类，2,4-D常用，并且利用2,4-D浓度调节
再生途径“器官发生”或“胚胎发生”。一般浓度
较高时，胚胎发生；浓度较低时，器官形成。
4）、培养方式 可以固体培养，也可以液体培养。有报道液体培养 优于固体培养，但必须将液体培养基中诱导的愈伤
第一节 植物小孢子发育过程

第一期，小孢子母细胞减数分裂形成四分体。 四分体的周围包裹着一层厚的胼胝质，随着胼 胝质的分解四个小孢子便分离开来； 第二期，单个小孢子继续发育。进行第一次花 粉细胞有丝分裂，分裂是不对称的，这种类型 的花粉粒称为A型；


第三期，小孢子发育形成成熟的花粉粒。标志： 细胞中明显出现两个核。
(microspore culture)。从培养方法和技术方
面来讲，它属于细胞培养的范畴。
一、花药、花粉培养的意义
1、缩短育种年限
控制杂种分离。

常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交， 通过不断选择和淘汰，一般需到F5-F6代
能得到纯合后代。

用杂种植株的花药、花粉(n)培养，得到 单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二 倍体(2n)。这样，从杂交到获得纯合株系， 只需二个世代。因此，可缩短育种年限34个世代。
2、提高选择效率
F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，
进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株
（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再
生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广 泛的变异类型。隐性基因可以得到充分表达。 单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因 此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大 提高育种选择效率。

2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提
高了诱导率。
3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。
因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层
逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。

无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉
启动，提高诱导率和再生率。
第四节 影响花药、花粉培养的因 素
1、花粉发育时期
已有250多种植物花药培养成功。

目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本 科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛 应用。 花药培养的基本程序是： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理－外植体消毒

－剥取花药－接种－诱导培养－分化培养
花药培养
花蕾预处理
柱头
花药 花丝 胚珠 子房 花托 花柱
1、材料的选择
第九章 体外单倍体诱导和
单倍体育种
重点和难点

掌握单倍体的体外诱导方法

体外单倍体诱导通常是指利用离体培养花药或小
孢子的方法，诱导形成单倍体植株。

单倍体育种是指将具有单套染色体的单倍体植物，
经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体，从中
筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具 有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材 料。