苹果树组培快繁技术实例 · 含配方
一种苹果组培苗快繁技术[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010977539.8(22)申请日 2020.09.17(71)申请人 昭通市苹果产业发展中心地址 657000 云南省昭通市昭阳区凤霞路47号(72)发明人 张丹 张秀英 李超 马勉娣 李云国 胡志芳 王顺富 汪琼 杜楠 谭安超 姚梅 陈晨 刘毅 黄先月 杨渊 (74)专利代理机构 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265代理人 刘阳(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称一种苹果组培苗快繁技术(57)摘要本发明提供一种苹果组培苗快繁方法，包括：将苹果组培苗先利用继代增殖培养基培养30～40天，再转接到生根培养基培养25～35天，最后将生根的组培苗进行营养钵移栽至移栽基质。
利用本发明提供的增殖培养基时增殖系数平均达到6.1，较之前技术提高了8.9％；利用本发明提供的生根培养基达到生根的效果，显著提高了组培苗生根率，平均达到85％，较之前技术提高了6.25％；利用本发明提供的移栽基质提高了组培苗成活率，达到75％以上，最高可达到85％，较之前技术提高了6.25％～7.14％。
权利要求书1页 说明书3页 附图4页CN 111903529 A 2020.11.10C N 111903529A1.一种苹果组培苗快繁方法，其特征在于，包括：将苹果组培苗先利用继代增殖培养基培养30～40天，再转接到生根培养基培养25～35天，最后将生根的组培苗进行营养钵移栽至移栽基质；其中，所述继代增殖培养基用于苹果组培苗的继代增殖培养，生根培养基用于组培苗生根培养，移栽基质用于组培苗生根达到移栽要求时移栽使用。
2.如权利要求1所述的苹果组培苗快繁方法，其特征在于，所述继代增殖培养基以1L MS培养基作为基本培养基计算，包括：硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，七水合硫酸镁370mg，磷酸二氢钾170mg，二水合氯化钙440mg，四水合硫酸锰22.3mg，七水合硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg ，碘化钾0.83mg ，二水合钼酸钠0.25mg ，五水合硫酸铜0.025mg ，六水合氯化钴0.025mg，七水合硫酸铁27.8mg，二水合乙二胺四乙酸二钠37.3mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，维生素B 60.5mg，维生素B 10.1mg，6-BA0.8mg，IBA0.2mg，蔗糖40g，琼脂6g，聚乙烯醇2g，PH6.0。
苹果矮化砧M9-T337组培繁殖技术
苹果矮化砧M9-T337组培繁殖技术韩秀清I徐世彦S成思琼蔦徐凌飞*（1西北农林科技大学园艺学院陕西杨凌712100；2陕西省果业研究发展中心；3杨凌新世界组培有限公司）中图分类号：S661.1文献标识码：B DOI编码：10.19440/ki.1006-9402.2019.03.009M9-T337是目前在苹果集约化栽培中应用较多的优良矮化砧木，随着矮砧集约栽培技术模式的发展,需要大量的M9-T337苗木满足不断发展的果业发展的需要。
M9-T337苹果矮化砧的繁殖主要通过组织培养、压条和扌千插等繁殖方法。
组织培养方法能保持亲本的优良性状，可以周年生产,不受季节限制，在生产中被大量应用。
我们进行了M9-T337苹果矮化砧组织培养快繁，具体技术如下：1无菌苗培养生长季节,选取脱毒砧木采穗苗圃的砧木幼嫩新梢长约3cm的茎尖置于培养瓶中,加入少许洗衣粉轻摇洗涤，用自来水冲洗2min后在超净台上用0.1% HgCL消毒洗涤8min,再用无菌蒸憾水充分洗涤6次,切掉变褐损伤部分接种于初代培养基上（MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.6g/L）。
外植体先在黑暗条件下培养1d o期间一旦发现有褐变的材料就马上转入新鲜的诱导培养基中，抑制外植体褐变。
然后转入光照（光照强度2000-3000Lx温度25±2°C,光照12h）的培养条件下培养。
2增殖培养将获得正常成活的无菌丛生芽分别切成单个的芽苗接种到增殖培养基（MS+6-BA0.6mg/L+NAA 0.03mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.6g/L）中进行继代培养，增殖系数平均为5〜7。
每隔30〜40d增殖转接一次，直至组培苗数量达到生产要求，开始进行生根。
3生根培养选择生长健壮株高1.5〜2.0cm的小苗转接至生根培养基。
生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+IAA 0.3mg/L,生根率平均为97.2%O培养条件:外植体先在黑暗条件下25±2C培养6〜8d,然后转入光照（光照强度2000-3000Lx,温度25±2°C,光照12h培养。
苹果的组织培养
苹果的组织培养苹果的组织培养是采用无菌培养技术, 将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、等器官以及他们的组织切片进行离体培养, 使之在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。
1973年Jones等培育苹果砧木M-26和M-9 的茎尖获得成功, 之后美国的Button等利用此技术大量繁殖了英国东茂林试验站育成的苹果砧木M-27 , 促进了其推广应用。
我国在这方面也进行了大量工作, 加速了苹果新品种的推广应用。
另外, 由于离体技术处理严格, 所以很容易脱除昆虫、一般真菌病害和一些细菌病原及病毒, 是复壮品种的有效措施。
已成功脱除的病毒和病害有苹果褪绿叶斑病毒、花叶病病毒、轮纹病等。
1苹果矮化砧组织培养（1）材料方法：苹果矮化砧GM256，春季芽萌动后取田间的枝条, 将萌发的新芽, 用自来水冲洗后75%酒精0.5～1 min,0.1%升汞5 min, 然后剥取0.5 mm 左右长的茎尖, 接种于诱导培养基上。
以MS 为基本培养基,pH 值为 5.8, 培养室温度24℃, 湿度60%左右。
将初代培养出的芽接种到增殖培养基上, 连续继代(每次25～30 d)2 次。
将长至2 cm 左右的试管苗接入生根培养基中诱导生根。
（2）结果：①外植体诱导。
外植体接种到诱导培养基中,在正常的光照培养条件下均不能诱导出芽,暗培养20 d 和30 d 的黄化苗经光照后很快变绿, 正常生长。
而暗培养40 d 的黄化苗玻璃化严重, 经光照后也很难正常生长。
诱导培养基中,60d后，当BA浓度低于2 mg/L,NAA浓度高于1mg/L 时不利于矮化砧芽的诱导。
IBA也不适宜矮化砧芽的诱导。
适宜的浓度和种类是: MS+BA2 mg/L + NAA0.1 mg/L。
②增殖。
诱导培养出的芽接种到增殖培养基上连续继代(每次25～30 d)2 次,在MS+BA2.0 mg/L + NAA0.05 mg/L和,MS+BA3.0mg/L+ NAA 0.10mg/L上苗生长健壮, 增殖快, 可增殖5～6倍。
果树类植物的快繁技术示例
果树类植物的快繁技术示例果树类植物的快繁技术示例一、果树类植物的快繁;（一）桃树的快繁1．桃快繁的意当前桃基本上采用嫁接繁殖，而且培育时间都是1~2年时间，繁殖效率不高，优良品种推广速度慢，难以适合产业发展对新品种的迫切需求。
另外，一些需用特异砧木进行性状改良或提高适地性桃树品种，如抗重茬砧木GF677，需用营养体进行繁殖，通常采用组培法来培育，成本较高难以普及。
还有些是栽培模式需要，如草地果园的台刈制度，就需要用快繁自根苗栽培。
另外，桃用快繁自根苗生产具有提早结果与提前丰产的优良特性。
这些技术的实施都得运用一种简易而实用的快繁技术，来解决生产上对种苗特殊需求，现就植物非试管克隆技术在桃树上的运用及快繁操作程序作些简单介绍。
2．母本培养与材料预处理桃在常规条件下，属于较难生根培育的品种，这与植物种性及阶段性的生理状况有关，虽然桃的品种很多，各种品种生根难易与特性都有所区别，但采用非试管快繁技术后，可以让这种区别最小化，操作标准统一化。
只有对桃树生根的障碍因子有所了解，才能制定快繁方案，影响桃生根的因子，因品种不同造成生根不同，而品种差异最终又是生长特性差异，造成离体材料生理状态差异来得以体现，所以不管什么品种，先对其进行母本园进行统一标准模式的管理，以缩小品种差异，求得较为一致的生根效果。
另外，母本不同生育阶段的差异，休眠期与生长期的差异，还有枝龄、叶龄上的差异，导致离体材料生理差异，这些也可以通过母本管理及预处理得以解决。
现就从桃的品种品系分析来制定相应对策，北方品系的桃往往需冷量高，冬季休眠程度较深，南方品种休眠浅而需冷量低，而导致休眠深浅原因，又是在不同地域进化过程中形成的生态适应性，它通过体内脱落酸含量高低，来达到休眠深浅的目的，内源脱落酸是可以经管理与技术措施实现人工调控的，如在落叶后的休眠期快繁，在进行快繁前，对枝条最好采用人工致冷，打破休眠处理后再快繁，否则成活率极低。
在生长季节快繁，影响生根的因子，主要是内源激素与碳源积累水平引起的差异，它表现为枝梢不同的老嫩程度及部位，这些可以对母本园进行枝梢的摘心处理，或增施pp333化控措施得以实现，也可通过肥水促长，重截促萌的方法来提高内源生长激素，或者结合外源喷施赤霉素与生长素来调控植株的生长发育。
苹果的组织培养
苹果的组织培养苹果的组织培养是采用无菌培养技术, 将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、等器官以及他们的组织切片进行离体培养, 使之在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。
1973年Jones等培育苹果砧木M-26和M-9 的茎尖获得成功, 之后美国的Button等利用此技术大量繁殖了英国东茂林试验站育成的苹果砧木M-27 , 促进了其推广应用。
我国在这方面也进行了大量工作, 加速了苹果新品种的推广应用。
另外, 由于离体技术处理严格, 所以很容易脱除昆虫、一般真菌病害和一些细菌病原及病毒, 是复壮品种的有效措施。
已成功脱除的病毒和病害有苹果褪绿叶斑病毒、花叶病病毒、轮纹病等。
1苹果矮化砧组织培养（1）材料方法：苹果矮化砧GM256，春季芽萌动后取田间的枝条, 将萌发的新芽, 用自来水冲洗后75%酒精0.5～1 min,0.1%升汞5 min, 然后剥取0.5 mm 左右长的茎尖, 接种于诱导培养基上。
以MS 为基本培养基,pH 值为5.8, 培养室温度24℃, 湿度60%左右。
将初代培养出的芽接种到增殖培养基上, 连续继代(每次25～30 d)2 次。
将长至2 cm 左右的试管苗接入生根培养基中诱导生根。
（2）结果：①外植体诱导。
外植体接种到诱导培养基中,在正常的光照培养条件下均不能诱导出芽,暗培养20 d 和30 d 的黄化苗经光照后很快变绿, 正常生长。
而暗培养40 d 的黄化苗玻璃化严重, 经光照后也很难正常生长。
诱导培养基中,60d后，当BA浓度低于2 mg/L,NAA浓度高于1mg/L 时不利于矮化砧芽的诱导。
IBA也不适宜矮化砧芽的诱导。
适宜的浓度和种类是: MS+BA2 mg/L + NAA0.1 mg/L。
②增殖。
诱导培养出的芽接种到增殖培养基上连续继代(每次25～30 d)2 次,在MS+BA2.0 mg/L + NAA0.05 mg/L和,MS+BA3.0mg/L+ NAA 0.10mg/L上苗生长健壮, 增殖快, 可增殖5～6倍。
苹果的组织培养技术及研究进度
苹果的组织培养技术及研究进度[摘要]苹果通过组织培养快速繁殖的技术简介，针对外植体不同介绍部分种类的苹果组织培养技术。
分析组培技术中重点问题的解决途径及其研究进度。
[关键词]苹果组织培养脱毒褐化研究进度一、苹果组织培养技术1.器官培养（花药培养）①培养程序花粉植株的诱导需要经过三个步骤：第一步是胚状体的诱导，花药接种后最早经过70天左右即由变褐的花药裂口处开始产生胚状体，一般是在接种后的90-120天开始产生胚状体；第二步是五根苗的诱导，即将胚状体转移到芽分化的培养基上可形成此生胚状体或丛生芽，进而发育成无根的支柱，这一过程，需经过40-100天左右或更长时间；第三步是根系的诱导，即将无根小植株转移到诱导跟的培养基上，以形成完整植株，需要15-20天左右。
②材料灭菌与培养条件为了得到不同品种的较多的胚状体，必须有足够的材料，而且要适时接种，但有时春季气温突然上升，往往在1-2天或2-3天就会错过接种最适时期。
因此，除了集中力量接种外，还需要建立材料妥善保存的方法，以延迟接种时间。
一般做法是将剪下来的花蕾枝插入盛水的玻璃缸内，保存在1-3摄氏度的冰箱中，这样可以控制和延迟花粉的发育时间。
试验表明，花蕾低温贮存40天接种，仍能形成胚状体。
材料的灭菌方法是：先摘取花蕾，去掉幼叶，注意将粘连的花蕾分开；先将材料进入70%酒精中约半分钟，取出花蕾，再浸入10%漂白粉上清液中约15-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，即可将材料置于灭菌的培养皿中。
培养室的温度应保持在25-30摄氏度，光照1500-2000Lux，每天关照10小时。
在胚状体诱导阶段，光和暗培养均能诱导出胚状体。
③无根芽丛的繁殖由于每个胚状体最多只能发育成一株完整植株，这些植株再经几次转移、染色体鉴定和移栽等，会有很多的植株中途夭折。
为了避免材料损失，胚状体转入芽丛分化的培养基中即MS培养基附加GA0.1mg/l、IBA0.5mg/l，BA1mg/l，使胚状体在这种培养基上迅速增值，形成很多次生胚状体或直接分化出芽。
一种提高苹果砧木组培苗快繁效率的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110022203.0(22)申请日 2021.01.08(71)申请人 山东农业大学地址 271018 山东省泰安市岱宗大街61号申请人 北京市植物园(72)发明人 毛云飞 陈春玲 胡艳丽 曹颖 贺然 魏钰 樊金龙 尹伊君 崔雪丽 龚丽娟 关洛非 孙楠 王悦 张桐源 郭翎 沈向 (74)专利代理机构 济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业) 37240代理人 薛鹏喜(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称一种提高苹果砧木组培苗快繁效率的方法(57)摘要本发明公开了一种提高苹果砧木组培苗快繁效率的方法，包括外植体接种、一次快速继代培养、回复继代培养、二次快速继代培养和缩时继代培养的步骤。
采用本发明的方法可在缩时继代培养时，20‑25天增殖系数为6.11倍左右，高度为5.23cm左右，且可保持同样的增值系数达5代以上，不仅大幅提高了苹果砧木组培苗的生长速度及增值系数，而且缩短了传统的苹果砧木的组培1/3‑1/2的时间，可加快苹果砧木组培苗的优质高效生产。
权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 112772414 A 2021.05.11C N 112772414A1.一种双快一回复提高苹果砧木组培苗快繁效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将苹果砧木外植体接种到诱导培养基中，培养20‑25天，形成不定芽芽丛；所述诱导培养基为添加有0.6mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS 培养基；(2)切取步骤(1)培养后形成的不定芽芽丛接种到一次快速继代培养基中，连续继代培养3代，每代培养10‑15天；所述一次快速继代培养基为添加有1mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS培养基；(3)将步骤(2)连续继代培养后的组培苗接种到回复继代培养基中，继代培养1代，培养20‑25天；所述回复继代培养基为添加有0.6mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS培养基；(4)将步骤(3)回复继代培养基中培养1代后获得的组培苗接种到二次快速继代培养基中，二次连续继代3代，每代培养10‑15天；所述二次快速继代培养基为添加有1mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS培养基；(5)将步骤(4)二次快速继代培养3代后的组培苗接种到缩时继代培养基中，继代培养1‑5代，每代培养20‑25天；所述缩时继代培养基为添加有0.6mg/L 6‑BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS培养基。
利用苹果组培小苗繁育多侧枝大苗的关键技术
图3组培苗大田定植近年来，陕西省千阳县依靠农民专业合作社及生产大户利用苹果组培小苗（图1）繁育多侧枝大苗（图2），具有成本低、繁育速度快、苗木质量好等优点。
其技术措施如下：图1苹果组培苗图2多侧枝大苗1选地选择自然条件优越的区域作为育苗地，要求20年内未栽植过苹果、梨等仁果类果树，周围1千米内没有仁果类的有病毒果园，且地面平整、地势高燥、土壤肥沃、以沙壤土为宜，园地不易落霜、非冰雹带；具备充足水源，可安装滴灌设施，灌溉及时方便。
2规划对育苗地要进行科学规划。
一是田间道路。
田间作业道一般宽3米，地块顶头作业道宽6米，便于大型机械作业。
二是灌溉设施。
包括主、支管道的位置、埋土深度及滴灌管的铺设长度等要综合考虑，确保全园都能灌溉到位。
三是栽植行向。
以地块长边作为苗圃地的行向，行距为80厘米，用白灰划成实线，便于栽苗操作。
四是库房建设。
库房需规划在地块一侧，外与大路连接，内与作业道相通。
3整地对育苗地要进行清理、深翻和施肥。
先清理地面农作物秸秆及枯枝、杂草、石块等杂物，再撒施生物有机肥（如果施用农家肥，一定要充分腐熟，否则会产生大量蛴螬，影响小苗栽植成活率），每亩250~500千克；结合撒施土壤杀虫剂，每亩2.5~4千克。
撒施完后，全园深翻耙磨2~3遍，深度在30厘米以上，使土壤疏松、地面平整光洁。
4选苗选择M9－T337或B9等优良组培苗，组培苗必须经过室外充分炼苗，生长充实，高度在10厘米以上，且整齐度好、根系发达、叶片浓绿、无病虫危害、无皱皮失水。
5栽植春、夏、秋三季均可栽植组培小苗。
栽植时，沿行线挖穴，行距80厘米，株距30厘米，栽植深度12~15厘米，每亩栽植2779株；栽植后营养钵上端略低于地面(营养钵为降解袋的不用去掉，非降解袋的要去掉)，根际土壤踏实拍平；及时浇水，栽植当日最好灌溉一遍，每亩灌水量应在5立方米以上，以渗透地表20厘米深的土层为宜，灌水后要覆土保墒（图3）。
6管护干性差的M9－T337等组培苗，因容易偏斜，在生利用苹果组培小苗繁育多侧枝大苗的关键技术李红英，薛永发，杨晓娟（千阳县果业发展中心陕西千阳721100）（下转第9页）图5铺设新型反光膜长期要插支杆（竹竿或玻璃纤维杆均可，高度1.3米），使苗木端直生长。
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苹果的组织培养是采用无菌培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、鳞片、块根和球茎等器官以及它们的组织切片进行离体培养，使之在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。
由于离体技术处理严格，所以很容易脱除一些细菌病原及病毒，是复壮品种的有效措施。
已成功脱除的病毒和病害有苹果褪绿叶斑病毒、花叶病病毒、轮纹病等。
苹果矮化砧、抗寒砧的组织培养也已成功。
苹果脱毒组培技术流程具体如下。
一
外植体材料选择与处理
早春，将上年芽接或切接的盆栽长富2号苹果苗移人温室，待新梢长出3～5片新叶时，放入热处理箱中，37℃恒温热处理30d或32℃与37℃每8h变换一次，变温热处理60d。
脱毒率可达80％以上。
热处理结束后，从盆栽苗嫩梢上采集生长旺盛、长约2～3cm顶梢，流水冲洗10min，去掉小叶。
70％乙醇浸泡30s，蒸馏水冲洗后放入0.1％HgCI。
中消毒10min，无菌水冲洗3～5次，解剖镜下迅速剥取1.0mm的茎尖进行分离培养，接种于起始培养基上。
二
培养基制备
1.1 芽诱导
适宜苹果芽诱导培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。
诱导的芽生长正常可发育成新梢。
1.2 继代培养
选择诱导的芽丛切割成单芽茎段，转接于设计的继代培养基上。
适宜的苹果继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖4％+琼脂0.36mg/L。
培养条件：光照强度2000～
2500lx，光照时间14～16h/d，适宜温度为25℃±2.0℃。
40d后增殖6.1倍。
1.3 生根培养
选择生长正常的继代培养苗，剪成单芽茎段，插入生根培养基中，苹果适宜的生根培养基为：1／2MS+IAA1.5mg/L+蔗糖25％+琼脂0.36％。
培养30d后，平均4～6条根／苗，长达0.5～1.0cm。
根白且粗，多直接生于茎基部。
三
培养条件
温度26～30℃，光照强度1500～2000LX，10h/d。
四
炼苗、移栽
强光闭瓶锻炼生根苗20～25d，不定根长至1cm时，将培养瓶移至自然强光下，不去封口膜继续培养20d左右，使试管苗幼茎更加充实健壮。
光太强时可遮阴，控制温度在35℃以下。
闭瓶锻炼后开瓶锻炼，除去封口膜，继续锻炼2～5d，使试管苗适应低湿环境。
然后从瓶内取出经过锻炼生根的试管苗，洗去根部的培养基，移栽于营养钵中(基质为田园土：腐熟发黑锯末；河沙=1:2:1混合配制)，于温度25℃的塑料大棚中培育。
将营养钵小苗放在塑料大棚内加盖有薄膜的小拱棚内，早晚各洒水1次，1～3d保持相对湿度在85％以上，基质水分不宜过多。
1周后开始逐渐揭膜通风，直至完全除去薄膜。
过渡移栽约30d，地上部分生长到
10cm左右时可移至大田。