浅谈高效液相色谱的应用与发展

浅谈高效液相色谱的应用与发展

Peishan Zou

摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法。本文旨在从仪器原理、仪

器结构、应用范围、检测效率、检测准确度等方面简要介绍液相色谱分析法，及在不同领域的

应用情况和本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。着重对高效液相色谱的发展现状进行

总结，并根据发展趋势而延伸，预测未来液相色谱仪的技术发展路线。

关键词：高效液相色谱；应用；发展现状；发展趋势

1. 高效液相色谱的发展历史简况

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。

高效液相色谱法是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域，在化合物的分析方面，世界上约有80% 的化合物，如括高分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(如正相 HPLC、反相 HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等等)进行分离分析[1]。

站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。

2.高效液相色谱仪的原理与构造

2.1 高效液相色谱仪的构造

高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC 仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求[2]。

（1）高压输液系统

高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。

其中，高压输液泵是高效液相色谱仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa。输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度[1]。因此，输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和分析结果的可靠性。

（2）进样系统

进样能在试样引入色谱柱，有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

图1 六阀手动进样器示意图

（3）色谱分离系统

色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。常用的填料为硅胶，可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。其中、最常用的是十八烷基键

合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

（4）检测系统

检测系统用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、红外检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱检测器(MSD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)。

（5）数据处理系统

高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据。

图2 高效液相色谱仪的构造示意图

2.2 高效液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被

分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来[4]。

3.高效液相色谱仪的应用

3.1 高效液相色谱仪在食品安全领域的应用

3.1.2 食品添加剂的检测

食品添加剂主要常用的有三类：分别是防腐剂、甜味剂和色素。添加剂的检测方法多种多样，例如气象法，比色法等，但是液相色谱法的优势非常明显，故现代检测技术中，多偏向于使用液相色谱法来检测。

在防腐剂检测方面，骆和东等[5]用Hypersil ODS色谱柱，流动相为0.02mol/L pH5.0乙酸铵甲醇溶液，柱温35℃，在不同波长下同时测定苯甲酸和山梨酸。

在合成色素的检测方面，吴敏[6]等采用Zorbax 80A Extend—C8色谱柱，高效液相色谱仪配备紫外检测器，同时测定食品中对位红和苏丹红等8种脂溶性燃料。

近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、苋菜红、亮蓝这十种食品常用添加剂。其效率之高非其他仪器分析方法可比。

3.1.2 食品中危害物质的检测

食品中有害物质主要可分为：农药、兽药残留；霉菌毒素；重金属；加工过程中高温或其它特殊条件下形成的致癌物质等。

黄曲霉毒素普遍存在于多种谷物类食品当中，具有极强的致畸致癌作用，王君[7]等用HyPersil ODS—C18色谱柱，测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量，该方法方便快捷，定性准确，较传统的点板法，酶联免疫吸附法更为科学准确。

高效液相色谱法在应对2008年奶粉掺入三聚氰胺风波的检测中发挥了重要作用，面对全国众多乳制品企业的样品进行检测，尽快出具检测结果给老百姓一个公正准确的结果，检测方法必须既要快，又要准，检出量还非常微小，能做到完美完成这一任务的，仅有高效液相色谱法能够做到。目前检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法、气相色