高效液相色谱的应用 ppt课件
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
高效液相色谱操作步骤ppt课件
2：冲洗进样系统
a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳 到头，用一次性平头微量注p射pt课器件完吸整 入2~4ml的50%甲 14
十二：关机
依次关闭检测器的氘灯 将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关 关闭高压泵开关 关闭仪器色谱工作站 关闭检测器电源开关 关闭高压泵电源开关 关闭柱温箱电源开关 关闭电脑开关 关闭稳压电源开关 并在仪器使用登记本上记录p环pt课境件完温整 度、湿度、仪器工 15
分析速度快等。
拧紧色谱柱的接口
ppt课件完整
6
四：放置流动相
1：将储存流动相的贮 2：更换仪器泵头里清 液瓶放置于贮液瓶架上 洗瓶中的超纯水（以确 保仪器外回路系统清洁 和良好的工作状态）
清洗瓶
ppt课件完整
7
五：开机
依次打开： 稳压器 柱温箱 高压泵 检测器 计算机电源开关
ppt课件完整
2：设定分析方法的方
法文件（文件名称，表
示浓度的单位）
3：设定样品分析表
简（而标言准之名称：、软测件定的次各数种、设置；繁杂但不复杂
样品名称、编号）
ppt课件完整
11
九：进样分析
1：启动设置程序文件、 设定分析方法的方法文 件、设定样品分析表按 照样品分析表的顺序， 用平头微量注射器将经 过0.45um滤膜过滤的标 准溶液和样品溶液逐次 注入六通进样阀中，
头）进入高效液相色谱 用一次性注射器和一次
仪样品液都必须经过样 性滤头过滤后，加入2ml
品过滤装置过滤
具塞试管中备用。
一次性滤头：由机系、水系组成；
滤膜的孔径为0.45um
ppt课件完整
5
三：色谱柱的连接
将色谱柱按流动相流动 方向即色谱柱标示箭头
a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳 到头，用一次性平头微量注p射pt课器件完吸整 入2~4ml的50%甲 14
十二：关机
依次关闭检测器的氘灯 将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关 关闭高压泵开关 关闭仪器色谱工作站 关闭检测器电源开关 关闭高压泵电源开关 关闭柱温箱电源开关 关闭电脑开关 关闭稳压电源开关 并在仪器使用登记本上记录p环pt课境件完温整 度、湿度、仪器工 15
分析速度快等。
拧紧色谱柱的接口
ppt课件完整
6
四：放置流动相
1：将储存流动相的贮 2：更换仪器泵头里清 液瓶放置于贮液瓶架上 洗瓶中的超纯水（以确 保仪器外回路系统清洁 和良好的工作状态）
清洗瓶
ppt课件完整
7
五：开机
依次打开： 稳压器 柱温箱 高压泵 检测器 计算机电源开关
ppt课件完整
2：设定分析方法的方
法文件（文件名称，表
示浓度的单位）
3：设定样品分析表
简（而标言准之名称：、软测件定的次各数种、设置；繁杂但不复杂
样品名称、编号）
ppt课件完整
11
九：进样分析
1：启动设置程序文件、 设定分析方法的方法文 件、设定样品分析表按 照样品分析表的顺序， 用平头微量注射器将经 过0.45um滤膜过滤的标 准溶液和样品溶液逐次 注入六通进样阀中，
头）进入高效液相色谱 用一次性注射器和一次
仪样品液都必须经过样 性滤头过滤后，加入2ml
品过滤装置过滤
具塞试管中备用。
一次性滤头：由机系、水系组成；
滤膜的孔径为0.45um
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5
三：色谱柱的连接
将色谱柱按流动相流动 方向即色谱柱标示箭头
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
高效液相色谱方法及应用课件
未来发展趋势与展望
超高效液相色谱（UPLC）的普及与发展
随着色谱填料制造技术的进步，UPLC将逐渐成为主流技术，进一步提高分离效率和检 测灵敏度。
联用技术的发展
HPLC将与其他分析技术（如质谱、红外光谱等）更紧密地结合，实现多维、多组分的 同时分析，提高分析速度和准确性。
微纳流控芯片的集成与应用
随着微纳加工技术的发展，HPLC将与微纳流控芯片集成，实现样品制备、分离和检测 的一体化，为便携式、即时分析提供可能。
PART 06
高效液相色谱法的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
01 02
分离效率的提高
随着样品组分的日益复杂，分离效率的提高成为HPLC技术面临的重要 挑战。解决方案包括开发新型填料、优化色谱柱参数以及采用先进的色 谱分离技术。
检测灵敏度的提高
对于痕量组分的分析，提高检测灵敏度是关键。解决方案包括采用高灵 敏度检测器、优化检测条件以及发展超高效液相色谱技术。
实验操作流程
流动相制备
根据实验要求，制备适量的流动 相，确保其比例、纯度和稳定性 符合要求。
样品处理
对样品进行预处理，如溶解、过 滤、稀释等，以便进行后续的液 相色谱分析。
柱子安装与条件优化
根据实验需求，选择合适的色谱 柱，并进行安装和条件优化，以 提高分离效果和实验效率。
进样与检测
将处理好的样品注入进样器，按 照设定的条件进行分离和检测， 记录数据。
发展历程与趋势
发展历程
HPLC技术自20世纪60年代问世以来， 经历了不断改进和完善的过程，已成 为一种成熟且广泛应用的分析方法。
发展趋势
随着科技的进步，HPLC技术正朝着 高分离度、高灵敏度、自动化和智能 化的方向发展，同时与其他分析技术 的联用也成为了研究热点。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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作为一种可以抵抗真菌、细菌的天然的和半人工合成的物质， 在水产品中使用大量的抗生素，很难被充分利用再排出体外，一旦 进入水产品中很容易对环境造成污染，通过食物链也会对人体健康 造成影响，有的抗生素甚至有致癌因子，所以，使用抗生素时应该 慎重。
液相串联质谱检测仪在很大程度上能对抗生素的含量分布进行
测定，对残留物的处理也有一定的方法。但是，在实验检定时应该 对实验数据严格规范，这种操作选择性强、灵敏度高、重复性好， 在水产品抗生素的检测方面有着广泛的应用。
设备与试剂的选择
高效液相色谱仪，均质器，氮气浓缩装置，超声波发生器，快速混匀器均，旋转蒸发仪，高速台式 离心机，电子分析天平。对试剂的选物。
样品前处理以及液相色谱条件
取样、称取、离心、移液 ；蒸馏提取（乙腈是合适的溶剂）。 液相色谱条件的选择包括ODS-C18（4.6 mm×250 mm）的色谱柱，DAD 检测的二极管阵列检测器， 对液相质谱串联仪的波长选择268 nm，进样量控制在30 μL，一般来说柱温控制在35 ℃，对于流动相而言 采取乙腈—3% 冰醋酸，梯度淋洗0 ～ 151.3.2 min，一般流速为0.6 mL/min，乙腈与3% 冰醋酸的体积比为 20 ∶ 80，如果1 min 内，流速提高至1.0 mL/min，那么乙腈与3% 冰醋酸的比为40 ∶ 60。
液相串联质谱仪检测水产品中 相关抗生素残留的研究
优化磺胺类抗生素的痕量检测以及前处理，观察盐度
研 对回收率的影响。
究
主要借助HPLC法研究水产品中磺胺类药物的提取、净
目
化，对分离磺胺类药物给出更优良的方法，这种方法精确
标
度高且易操作，可以有效监控磺胺类药物的残留。
磺胺类药物的残留检测以及前处理实验
在水产品抗生素的检测时还可以与其他方法结合，使鉴定结果 更为准确，对消除水产品中的抗生素残留物也有很大的借鉴意义。
Thank you！
液相串联质谱检测的最佳实验条件的选择
1. 最佳pH 值
pH 值在3.5 时取得最佳萃取值。
2.最佳盐浓度
在磺胺类药物的回收利用时应该将盐度控制 在0.5% 左右，保证萃取效果达到最佳状态。
3.最适合萃取温度
实验温度应该确定在80 ℃。
4. 最佳萃取时间
最佳萃取时间为15 min。
5.最佳离心时间
在磺胺类药物的萃取时应该将 离心时间控制在10 min。