ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR

产品信息

Thermo Scientific

Maxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642

/onebio

分析证书

经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。

质量授权人：Jurgita Zilinskiene

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试剂盒组分 (4)

贮存条件 (4)

产品描述 (4)

重要提示 (5)

RT-qPCR实验方案 (6)

对照反应 (6)

疑难解答 (7)

参考文献 (8)

试剂盒组分

贮存条件

所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。

产品描述

Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。合成反应能在15-30分钟内完成。

Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。

Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。

5×反应混合液包含剩余的反应组分：反应缓冲液、dNTPs、Oligo(dT)18和随机引物。

无核酸酶的水用于反应体系的配制和RNA样本的溶解。已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸酶和磷酸酶。

重要提示

避免核糖核酸酶污染

RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至为重要。RNA能够被RNase A降解，而在任何实验环境中都能发现这种稳定的污染物。本试剂盒中所有成分都经过严格检测，确保其不含RNase。为了避免污染，实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含RNase。

避免RNase污染的一般建议：

∙使用确保无核酸酶的实验器具，或者用DEPC水处理cDNA合成中所用到的反应管和枪头等。

∙整个实验过程中请戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。同时实验过程中注意经常更换手套。

∙使用无核酸酶的试剂，包括高纯度的水（如无核酸酶的水，#R0581）。

∙未使用试剂盒时请严格密封保存。在反转录过程中，所有反应管要确保扣严。

模板RNA

通过标准方法分离的总细胞RNA适用于该试剂盒。纯化的RNA需确保不含盐分、金属离子、乙醇和苯酚，以防其抑制cDNA合成反应。

对于RT-PCR，模板RNA需确保没有DNA污染。在cDNA合成之前，可先用无核酸酶的DNase I（#EN0521）去除痕量DNA。

实验中需要逆转录酶负对照反应。该反应含有除Maxima Enzyme Mix以外的所有其他RT反应组分。

RNA样本质量

在合成cDNA之前需对RNA的完整性进行评估。真核生物总RNA能够通过琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色来分析检测。如果总RNA电泳后有18S和28S rRNA的锐利条带，可认为RNA是完整的。28S RNA条带的亮度大约为18S rRNA条带的两倍。rRNA条带出现任何拖尾现象都表示mRNA存在降解。如果这种情况发生，需重新制备总RNA样品。另外，也可用生物分析仪器（如Agilent 2100）分析总RNA，该仪器能对RNA样本的大致状况，RNA的完整数（RIN）（2）进行定量。内参基因/目的基因3’:5’完整性分析（3）也能用于检测RNA样本的完整性。

引物

Maxima第一链cDNA合成试剂盒包含Oligo（dT）18引物和随机引物，以引导第一链cDNA的合成。该引物混合物可确保检测低拷贝转录物时的高灵敏性。

RT-qPCR实验方案

开始前请阅读本手册的重要提示部分（第5页）。

第一链cDNA合成

第一链cDNA合成反应可以以单个反应进行，而对于不同的RNA模板，也可以进行一系列的平行反应。因此，反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合，也可以将RT反应中除了RNA模板外的所有组分制成预混液。

解冻后，轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分。冰上放置。

1.的反应管中。

2.

3.25℃孵育10分钟，之后再50℃孵育15分钟。

注：若RNA模板量大于1 μg，则延长反应时间至30分钟。若RNA模板富含GC或含有大量的二级结构，可将反应温度提高至65℃。

4.85℃加热5分钟以终止反应。

该反转录反应产物能够直接用于qPCR，或者在-20℃条件下存放一周。如需长时间贮存，推荐贮存于-70℃。另外应避免cDNA的反复冻融。

qPCR

第一链cDNA合成的产物能够直接用于qPCR。加入的合成的cDNA第一链产物体积不应超过PCR反应总体积的1/10。通常情况下，在25 μl体系的qPCR反应中加入2 μl合成的cDNA第一链作为模板。Maxima第一链cDNA合成试剂盒适于和Maxima qPCR master mixes （#K0221、#K0231、#K0241、#K0251、#K0261）搭配使用。

对照反应

实验中应利用如下负对照来确认第一链cDNA合成的结果。

Reverse transcriptase minus（RT-）负对照：RT-PCR和RT-qPCR中应利用此负对照来检验RNA样本中基因组DNA的污染情况。此负对照RT-反应含有除Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分。

无模板负对照（NTC）：此负对照用来检验试剂污染情况。NTC反应含有除模板以外的所有组分。