感受态制备注意事项
感受态的制备
感受态的制备
1.铺无抗性的LB平板。
为避免意外，一般铺两块无抗性LB平板。
2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。
这个过程要迅速，避免菌种发生冻融或污染。
3.将冰渣溶于1ml 37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml 37℃预热的LB的 EP中,混匀后取100ul涂板。
37℃孵育14个小时。
观察菌落数量和相关理化特征，用封口膜密封4℃冻存。
4.用牙签挑取单克隆至4～6ml无抗性LB小管中260rpm 12小时(活化)。
这一步可以多挑几个克隆，以防其长不出来和有明显的污染。
5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm 3小时。
注意观察，控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。
6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管（已灭过菌）中，冰浴10分钟。
7.5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。
离心机需要4℃预冷。
8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。
徒手将50ml离心管反覆戳于冰上从而使细菌重悬浮。
因为感受态细胞比较脆弱易破损，故重悬浮时不宜使用震荡仪。
悬浮要充分！
9. 5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。
10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。
注意事项同8。
11.以200ul每管分装，分装后冻存于-80℃。
注明制备日期和菌名。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌体验态细胞的造备战变化本理及注意事项之阳早格格创做1、体验态细胞的观念沉组DNA分子体中建立完毕后必须导进特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并下效表白中源基果大概曲交改变其遗传性状，那个导进历程及支配统称为沉组DNA分子的变化.正在本核死物中，变化是一个较一致的局里，正在细胞间变化是可爆收，一圆里与决于供体菌与受体菌二者正在进化历程中的亲缘关系，另一圆里还与受体菌是可处于一种体验状态有着很大的关系. 所谓的体验态：即指受体大概者宿主最易交受中源DNA片段并真止其变化的一种死理状态，是由受体菌的遗传性状所决断的共时也受菌龄、中界环境果子的效用.cAMP不妨使体验态火仄普及一万倍，而Ca2+也可大大促进变化的效用.细胞的体验态普遍出当前对付数死少久新陈幼老的细胞是造备体验态细胞战举止乐成变化的关键.造备出的体验态细胞姑且没有必时可加进占总体积15%的无菌苦油大概-70℃保存灵验期6个月.2、变化的观念及本理正在基果克隆技能中，变化特指将量粒DNA大概以其为载体建立的沉组DNA导进细菌体内使之赢得新的遗传个性的一种要收.它是微死物遗传、分子遗传、基果工程等钻研范畴的基础真验技能之一.受体细胞通过一些特殊要收，如电打法、CaCl2等化教试剂法处理后，使细胞膜的通透性爆收变更，成为能容许中源DNA分子通过的体验态细胞.加进细胞的DNA分子通过复造、表白真止遗传疑息的变化，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的变化时常使用化教法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年创造的.其本理是细菌处于0℃CaCl2的矮渗溶液中，菌细胞伸展成球形，变化混同物中的DNA产死抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲打处理，督促细胞吸支DNA 复合物，正在歉富培植基上死少数小时后，球状细胞复本并团结删值，被变化的细菌中沉组子中基果得到表白，正在采用性培植基仄板上可选出所需的变化子.Ca2+处理的体验态细胞其变化率普遍能达到5×106~2×107变化子/ug量粒DNA 不妨谦脚普遍的基果克隆考查.如正在Ca2+的前提上共同其余的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO大概还本剂等物量处理细菌，则可使变化率普及100~1000倍.化教法简朴、赶快、宁静、沉复性好，菌株适用范畴广，体验态细菌不妨正在-70℃保存，果此被广大用于中源基果的变化.除化教法变化细菌中，另有电打变化法，电打法没有需要预先诱导细菌的体验态，依赖短促的电打，督促DNA加进细菌，变化率最下能达到109~1010变化子/ug关环DNA.果支配烦琐愈去愈为人们所交受.3、体验态细胞造备及变化中的效用果素⑴、细胞的死少状态战稀度最佳从-70℃大概-20℃苦油保存的菌种中曲交转交用于造备体验态细胞的菌液.没有要用已通过多次转交及贮存留4℃的培植菌液.细胞死少稀度以每毫降培植液中的细胞数正在5×107个安排为好.即应用对付数期大概对付数死少前期的细菌,可通过测定培植液的OD600统造.对付TG1菌株OD600为0.5时,细胞稀度正在5×107个/ml安排.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.稀度过下大概缺累均会使变化率下落.别的受体细胞普遍应是节造-建饰系统缺陷的突变株，即没有含节造性内切酶战甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所变化的载体本量相匹配.⑵、量粒DNA的品量战浓度用于变化的量粒DNA应主假如超螺旋态的变化率与中源DNA的浓度正在一定范畴内成正比但是当加进的中源DNA 的量过多大概体积过大时则会使变化率下落.普遍天，DNA 溶液的体积没有该超出体验态细胞体积的5%1ng的cccDNA 即可使50ul的体验态细胞达到鼓战.对付于以量粒为载体的沉组分子而止，分子量大的变化效用矮，真验说明大于30kb 的沉组量粒将很易举止变化.别的沉组DNA分子的构型与变化效用也稀切相关，环状沉组量粒的变化率较分子量相共的线性沉组量粒下10~100倍，果此沉组DNA多数形成环状单螺旋分子.⑶、试剂的品量所用的CaCl2等试剂均需是最下杂度的，并用最杂洁的火配造，最佳分拆保存于4℃.⑷、预防杂菌战杂DNA的传染所有支配历程均应正在无菌条件下举止，所用器皿，如离心管、移液枪头等最佳是新的，并经下压灭菌处理.所有的试剂皆要灭菌，且注意预防被其余试剂、DNA酶大概杂DNA所传染可则均会效用变化效用大概杂DNA的转进.⑸、所有支配均需正在冰上举止没有克没有及离启冰浴可则细胞变化率将会落矮.。
电转感受态细胞的制备
电转感受态细胞的制备电转感受态细胞 (Electroporated sensitized cells) 是指通过电穿孔技术将外源 DNA 或 RNA 导入细胞内的一种技术。
该技术广泛应用于基因治疗、疫苗研究、基因编辑等领域。
本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项。
下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《电转感受态细胞的制备》篇1一、电转感受态细胞的制备方法电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿中，并在适当的条件下培养细胞，使细胞生长至对电穿孔敏感的阶段。
2. 制备电穿孔缓冲液：根据细胞类型和实验需要，选择适当的电穿孔缓冲液，将其制备好。
3. 处理细胞：将细胞与电穿孔缓冲液混合，并在一定条件下进行电穿孔处理。
4. 收集细胞：将处理后的细胞收集到离心管中，并进行离心。
5. 检测细胞：通过荧光显微镜或 Western blot 等方法，检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA。
二、电转感受态细胞的原理电转感受态细胞的原理是利用高电压电流产生的电场，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 或 RNA 通过细胞膜进入细胞内。
电穿孔过程中，细胞膜上的脂质分子重新排列，形成一个暂时的孔道，外源 DNA 或 RNA 通过这个孔道进入细胞内。
三、注意事项在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:1. 细胞选择：不同类型的细胞对电穿孔的敏感性不同，因此需要根据实验需要选择适当的细胞类型。
2. 电穿孔缓冲液：电穿孔缓冲液的组成和浓度对电转感受态细胞的制备非常重要，需要根据实验需要进行优化。
3. 处理条件：电穿孔处理的条件，如电压、电流、时间等，需要根据细胞类型和实验需要进行优化。
4. 检测方法：检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA 的方法需要与实验目的相符，并进行严格的对照实验。
《电转感受态细胞的制备》篇2电转感受态细胞是一种常用于分子生物学和基因工程领域的实验技术，它可以将外源 DNA 或 RNA 转入细胞中，从而实现基因转移和表达。
大肠杆菌感受态的制备注意事项
大肠杆菌感受态的制备注意事项一、前言大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
其感受态的制备是研究大肠杆菌生长和代谢机制的重要手段之一。
本文将从实验室条件、培养基、细胞处理等方面详细介绍大肠杆菌感受态的制备注意事项。
二、实验室条件1. 实验室应保持干净整洁，避免灰尘和异味影响实验结果。
2. 实验室应保持适宜的温度和湿度，避免过高或过低的环境温度对实验产生影响。
3. 实验室应定期消毒，确保操作台面、仪器设备等无菌。
三、培养基1. 选择合适的培养基是制备大肠杆菌感受态的关键。
常用的培养基有Luria-Bertani（LB）培养基、M9盐基培养基等。
根据实验需要选择适当的培养基。
2. 培养基应在使用前进行严格无菌处理，避免污染影响实验结果。
3. 培养基pH值应控制在合适的范围内，一般为7.0-7.5。
4. 培养基中添加的各种营养物质应按照实验要求精确称量，避免误差对实验结果产生影响。
四、细胞处理1. 大肠杆菌应在对数生长期进行处理，通常为OD600=0.6-0.8。
2. 细胞应在无菌条件下进行采集和洗涤，避免污染影响实验结果。
3. 细胞应在适当的温度下进行处理，一般为37℃。
4. 细胞处理过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
五、感受态制备1. 感受态制备前应将培养基和细胞等物品预先冷藏或冰冻，以保证制备过程中温度控制的准确性。
2. 制备感受态前应先将培养基预热至37℃，并加入相应浓度的感受态诱导剂（如IPTG）。
3. 加入诱导剂后，将细胞转移到含有诱导剂的培养基中，并在适当温度下孵育一定时间（通常为2-4小时）。
4. 制备过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
5. 制备完成后应及时取样，避免长时间放置影响实验结果。
六、结论以上是大肠杆菌感受态制备的注意事项。
在实验过程中，我们应该严格按照要求进行操作，保证实验结果的准确性和可靠性。
同时，在实验室管理方面也要加强管理，保证实验室环境的卫生和安全。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
dh5a感受态细胞的制备
dh5a感受态细胞的制备DH5α感受态细胞的制备引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，也是生物学实验中最常用的模式生物之一。
在分子生物学和基因工程领域，大肠杆菌被广泛用于蛋白质表达、基因克隆、DNA测序等实验中。
其中，DH5α感受态细胞是最常用的一种。
本文将介绍DH5α感受态细胞的制备方法。
一、实验前准备1.1 菌种选取首先需要选择适合自己实验需求的大肠杆菌质粒转化菌株。
DH5α感受态细胞是含有F-质粒（Fertility factor）的E. coli K12株系，具有高度敏感性和高转化效率，广泛应用于基因克隆、DNA测序等领域。
1.2 质粒DNA提取在进行质粒转化前，需要提取所需质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和纯化。
质粒DNA的提取方法有多种，如碱裂解法、酚/氯仿法等。
1.3 化学试剂准备进行DH5α感受态细胞制备的实验中，需要准备一些常用的化学试剂，如CaCl2、MgCl2、LB培养基等。
二、DH5α感受态细胞的制备方法2.1 菌株处理将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，用无菌吸管取出适量菌液接种到含有LB培养基的50mL离心管中。
在37℃恒温振荡培养器中进行预培养，转速为200rpm，时间为8小时左右。
2.2 转化体系制备将质粒DNA加入到含有CaCl2和MgCl2的转化缓冲液中，并在室温下静置15分钟。
其中转化缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl（pH 7.4）、100mM CaCl2、50mM MnCl2、100mM MgCl2。
2.3 转化处理将预培养后的DH5α感受态细胞进行离心处理，去掉上清液。
然后加入转化体系，并在室温下静置30分钟。
之后将样品加热至42℃水浴中进行热激处理，时间为45秒左右。
然后将样品放入冰水中进行冷激处理，时间为2分钟左右。
2.4 恢复处理将转化后的细胞加入到含有LB培养基的离心管中，并在37℃恒温振荡培养器中进行恢复处理，转速为200rpm，时间为1小时左右。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
农杆菌感受态的制备方法
农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。
注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。
挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。
第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。
注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。
第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。
注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。
摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。
4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。
6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。
7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。
注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。
8) 4℃，5000rpm 离心5min 。
9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。
10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。
注意：要用1ml 枪轻轻抽打。
11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
Inoue法制备化学感受态细胞及注意事项
1试剂的配制⑴5mol/L的KOH: 10mL称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL⑵0.5mol/L的PIPES pH:6.7称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。
⑶Inoue转化缓冲液的配制：500mL试剂需要量/500mL 终浓度MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/LCaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/LKCl（南京化学试剂一厂）9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/LH2O 补水至500 mL过滤除菌4℃冰箱存放备用2 .DH5a化学感受态细胞的制备⑴第一天划平板：DH5a从-80℃冰箱冻存管划线至LB平板，37℃培养箱培养，约12hrs.⑵第二天接种子瓶：从平板挑单clone至种子瓶20mLLB Media中,37℃，220rpm摇床过夜.⑶第三天接子瓶：从种子瓶吸取一毫升DH5a种子菌液至子瓶中，25℃，220rpm摇床培养，约6～7hrs.⑷测OD：待OD值约为0.6时开始制作(离心机事先预冷)①将培养好的菌液转移至灭菌的50mL离心管中，置于冰上10min至菌液冰冷.②4℃,2500g离心10min.③弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．④向５０ｍＬ离心管中加约１６ｍＬ的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液，重悬细菌沉淀（轻轻重悬，不要用振荡器或吹吸混匀）。
⑤4℃,2500g离心10min。
⑥弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．⑦每管各加入５ｍＬＩｎｏｕｅ缓冲液，轻轻悬浮。
⑧每管各加入３７５ｕＬＤＭＳＯ，混匀，冰上１０ｍｉｎ．⑨每管１１０uＬ，快速分装并冷冻。
－８０℃，备用。
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
西医学是最近三四百年来建立在解剖学 、生物 学及现 代科学 技术基 础上、 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，从 宏观到 微观， 直至目 前的分 子基因 层次水 平，发 展极为 迅速， 超过其 它任何 一门医 学科学 决目
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均 应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试 剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶 或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要 的麻烦。
四、注意事项
➢ 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。 2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养 45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照: 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板(Amp终浓度 50ug/ml)和空白平板
酵母感受态yih制备
酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。
下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。
一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。
二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。
当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。
2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。
3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。
转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。
4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。
三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。
2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。
3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。
4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。
5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。
四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。
2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。
3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。
感受态制备
一、感受态制备新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于3ml LB液体培养基中，过夜培养12h；2）取过夜培养物接入50ml LB+0.5M 山梨醇，37℃，200rpm培养至对数生长期OD600=0.85~0.95（控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD≈0.2，大约3-4h）；枯草芽孢杆菌T0期（对数生长期末期到稳定期）形成感受态，3）取全部菌液冰浴10 min，然后5000rpm，6min，4℃离心收集菌体；4）用30ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油）重新吹悬菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗4次；5）将洗涤后的菌体吹悬于0.5 ml电转培养基中，分装60μl/ 管,直接电转化，或者于-80℃保藏。
制备感受态细胞注事项：1. 每次制备感受态细胞的致敏缓冲液都应该新鲜配制；2.感受太细胞在－80℃储存5－6周后，其转化率会降低，可以用已知标准闭环质粒来鉴定感受态细胞的转化能力；3.制备感受态用的器皿（三角瓶，离心杯，电转化杯）都要洗刷干净，不要有任何去污剂和离子的残留；4.整个过程要低温；5.摇菌的OD值不要超过1；6.在10% 甘油+0.5山梨醇+0.5甘露醇的基础上再加入0.5M海藻糖，可提高转化率。
7.平板抗性可适度降低；8.复苏时提高溶氧将低转速。
二、电转化1）将60μl感受态细胞中加入50ng质粒DNA（1~8μl），冰上孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。
(感受态细胞从-80冰箱拿出来后在冰上融化，DNA样品加入感受态也要在冰上完成，并且混合后立刻擦干电转)电转仪设置：2.0kv（25μF 200Ω1mm ）电击1次（时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）2）电击完毕取出杯子并立即加入（在酒精灯旁即可）1ml RM动作要轻柔（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，120rpm，复苏3h;3）5000 rpm离心,5分钟,弃上清剩100ul，涂板37℃，过夜培养。
感受态细胞的制备
一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rp m，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm 离心10分钟。
5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm 离心10分钟。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1. 5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。
同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况，并记录。
二、连接产物纯化1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:10μl of ddH2O2μl of 3M NaAC（PH5.2）50μl of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；三、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15％的无菌甘油或—70℃保存有效期6个月。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项一、引言大肠杆菌感受态细胞是一种重要的实验材料，用于研究细胞信号转导等生物学问题。
制备感受态细胞需要注意许多事项，本文将从实验前的准备、菌种的选取、培养条件的控制、质量检测等方面进行详细阐述。
二、实验前的准备1. 实验室环境要保持干净卫生，避免灰尘和异味对实验产生影响。
2. 实验器具和试剂要提前清洗消毒，确保无菌状态。
3. 实验人员要做好个人卫生，穿上实验服和手套，并进行必要的消毒处理。
三、菌种的选取1. 选择适合自己实验目的和条件的大肠杆菌品种。
2. 选择优质的菌株，如DH5α或BL21(DE3)等常用品种。
3. 菌株应该保存在低温下，并定期检测其纯度和活性。
四、培养条件的控制1. 培养基应该选择适合大肠杆菌生长和表达蛋白质所需营养物质组成的培养基。
2. 培养温度、pH值、氧气含量等条件应该根据不同的菌株和实验目的进行调整。
3. 需要注意的是，大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行诱导，诱导剂类型、浓度和时间等参数也需要进行优化。
五、质量检测1. 感受态细胞的制备应该进行一系列质量检测，包括蛋白质表达水平、纯度和活性等方面。
2. 蛋白质表达水平可以通过Western blot或SDS-PAGE等方法进行检测。
3. 纯度可以通过蛋白质纯化和质谱分析等方法进行检测。
4. 活性可以通过生物活性实验或酶活性分析等方法进行检测。
六、其他注意事项1. 实验过程中要保持细心、耐心和严谨，避免操作失误影响实验结果。
2. 实验数据应该记录详细并及时处理，避免数据丢失或混乱。
3. 实验结果应该经过统计分析并与文献资料进行比较，确保结果可靠和准确。
七、结论大肠杆菌感受态细胞的制备是一个复杂而重要的实验过程，需要注意许多事项。
只有在实验前的充分准备、菌株的选择、培养条件的控制、质量检测等方面做好工作，才能获得高质量的感受态细胞，并为后续研究提供可靠的实验材料。
感受态细胞制备的注意事项
感受态细胞制备的注意事项1. 操作的时候可一定要细心啊！就像做一件精细的工艺品一样，一点儿马虎都不行。
比如你在接种细菌的时候，稍微不注意量多了一点，那可能整个都白费啦！2. 实验环境得保持干净呀！这可不能开玩笑，想想看，如果周围脏兮兮的，那不就好像把宝贝放在了垃圾堆里，还能好吗？就像你不会在满是灰尘的房间里放珍贵物品一样！3. 所用的试剂可得是高质量的哟！可别贪小便宜用那些不靠谱的，到时候制备不出来可别哭鼻子呀。
就好比给汽车加劣质油，能跑得顺畅吗？4. 温度控制得严格把控呀！多一度少一度都可能出大问题呢。
这不像洗澡水，热一点冷一点关系不大，这可是很关键滴！比如你要把细胞放在特定温度下培养，温度不对那不就坏事啦！5. 整个过程都要快速准确呀！不能拖拖拉拉的，时间可不等人。
就像跑步比赛，你慢悠悠的还能拿到好成绩？比如在转移细胞的时候，慢慢腾腾的可能就失活啦！6. 无菌操作要牢记在心啊！这可不能马虎，要是染上杂菌，那不就全完啦。
这就像守护宝贝一样，得小心翼翼的，不能让任何“坏蛋”入侵呀！例如在操作时不注意无菌，就等于把细胞往火坑里推呀！7. 注意观察细胞的状态呀！别光顾着做别的，不看看它们怎么样了。
这就跟照顾小朋友一样，得时刻留意着。
要是没注意到细胞状态不对，那不就糟糕了？8. 细节决定成败啊！每一个小步骤都不能轻视。
想想看，一艘大船不也是由一个个小零件组成的嘛，一个小地方出问题都不行呀！比如说忽略了一个小小的操作细节，可能就前功尽弃啦！9. 自己得有耐心和责任心呀！不能做到一半就不耐烦了。
这就跟跑马拉松一样，得坚持到最后呀！要是没耐心，那还能做成什么事呢？总之，感受态细胞制备可不是一件随随便便就能做好的事，得用心、细心、耐心！。
化学转化感受态制备
化学转化感受态制备化学转化感受态制备是分子生物学中常用的一种技术，通过此方法可以有效地将外源DNA引入到细胞内。
本文将详细介绍化学转化感受态制备的过程及相关注意事项。
一、化学转化感受态制备原理化学转化感受态制备是利用化学物质（如CaCl2）处理细胞，使其处于一种能高效吸收外源DNA的状态。
在这个过程中，细胞膜会发生改变，使得DNA能够更容易地通过细胞膜进入细胞内。
二、化学转化感受态制备步骤1.细胞培养：选取合适的宿主细胞，进行传代培养，使细胞处于对数生长期。
2.收集细胞：将对数生长期的细胞用离心机收集，弃去培养液。
3.洗涤细胞：用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养液。
4.重悬细胞：用适量的CaCl2溶液重悬洗涤后的细胞。
5.加入DNA：将待转化的DNA加入细胞悬液中，轻轻混匀。
6.化学转化：将细胞-DNA混合液置于冰浴中30分钟，使细胞充分吸收DNA。
7.恢复细胞生长：将化学转化后的细胞用预冷的PBS洗涤2次，然后加入新鲜培养液，恢复细胞生长。
三、注意事项1.选择合适的宿主细胞：不同的宿主细胞对化学转化的敏感性不同，需根据实验需求选择合适的宿主细胞。
2.细胞状态：进行化学转化时，细胞应处于对数生长期，此时细胞活力强，转化效率高。
3.DNA质量：使用高质量的DNA进行化学转化，可以提高转化效率。
4.温度控制：化学转化过程中，温度应严格控制在0-4℃，避免细胞受损。
5.转化后培养：化学转化后，需用新鲜培养液恢复细胞生长，以提高转化效率。
四、总结化学转化感受态制备是一种简单、高效的分子生物学技术，通过掌握该技术，研究者可以成功地将外源DNA引入到宿主细胞中，为后续实验奠定基础。
（注：本文仅作为学术交流，禁止用于商业用途。
沙门氏菌感受态细胞制备方法
沙门氏菌感受态细胞制备方法
沙门氏菌感受态细胞的制备方法如下：
1. 从冻存的沙门氏菌菌株中挑取一小块菌落，接种到含有适当培养基的培养皿中。
2. 在37℃的恒温培养箱中培养沙门氏菌菌株过夜，直到菌落生长得较为丰满。
3. 用无菌技术取出菌落，将菌落转移到含有适当培养基的试管中。
4. 将试管放入37℃的恒温摇床中，以适当的速度摇动培养。
5. 在培养过程中，定时取样检测沙门氏菌菌液的浓度。
一般情况下，培养12-16小时后可得到适量的感受态细胞。
6. 当细胞密度达到适当浓度后，用离心机将细胞沉淀下来。
7. 轻轻倒去上清液，将细胞沉淀用适当的缓冲液（如PBS）悬浮均匀。
8. 取少量悬浮细胞，用显微镜观察细胞的形态和数量，确保细胞的纯度和活力。
9. 根据实验需要，根据细胞操作的要求，对感受态细胞进行必要的处理，如滤液、冻存等。
注意事项：
- 在制备感受态细胞的过程中要严格进行无菌操作，防止外源性污染。
- 培养条件要保证适宜的温度、湿度和营养。
- 对于沙门氏菌感受态细胞的使用，应遵守相应的生物安全规定，确保实验操作的安全性。
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1>细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α
菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2>所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影
响转化。
3>经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）
4>化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）
5>所使用的器皿必须干净。
少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是
操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。
其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）
要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受
态的制备与转化方法。
以下是一些制备感受态的注意事项：
1、所用器具的洁净程度。
这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
2、培养基的装量。
培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。
厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。
建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量
=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培养基的pH值。
这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。
一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。
等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。
这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培养后的OD值。
其实这是一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已
经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等。
同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。
因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。
在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好
的效果。
6、培养温度。
文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
9、有报道说感受态制备之后放置24h效率会更好。
10、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。
化冻之后立即使用，不要冰上放太久。
11、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。