中国农业大学《基因工程》

基因工程：是在分子水平上进行的操作，指将多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞中，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。三要素：供体受体载体。

基因工程的主要内容：1.目的基因的获取2.重组体的制备 3.重组体的转化4、克隆鉴定5、目的基因的表达

限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切割双链的核酸内切酶。1、来源：原核生物2、性质：在核酸分子链的内部制造切口3、功能：自身保护作用（R/M 体系：保护自身的DNA不受限制，破坏外源的DNA使之迅速讲解）

影响限制酶活性的主要因素：1、DNA的纯度2、DNA 的甲基化程度3、温度4、缓冲溶液5、DNA的分子结构

Klenow片段：E.coli DNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。功能：1、3ˊ断的补平；2、DNA 3ˊ末端标记；3、cDNA第二链的合成。

平齐末端DNA 的连接方法：1、同聚物加尾法2、衔接物法；3、接头连接发。

双酶切相对单酶切的优点：可保证插入外源片段的方向，防止载体自连，提高重组率。

星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。部分酶切：指选用的核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。

发生部分酶切的原因：底物DNA纯度低；识别序列甲基化；酶用量不足；反应缓冲液和温度不适宜。

碱性磷酸酶和S1磷酸酶的功能：碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用，其产物具有5-OH末端，这种功能使它在DNA 分子克隆实验中发挥着重要作用，利用该酶可以有效防止粘性末端分子自连。

S1核酸酶：是一种高度单链特异的核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA，不仅能催化RNA和单链DNA 分子降解成为5单核苷酸，而且它也能作用于双链核苷酸单链区。功能：测定杂种核酸分子的杂交程度，给RNA分子定位，测定真核生物基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的DNA区域，从限制性内切酶产生的粘性末端中移去单位链突出序列以及打开双链cDNA合成期间形成的发夹结构。

载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

基因工程对载体的要求：1、在宿主细胞能独立复制2、有选择性标记3、有一段多克隆位点4、分子量小、拷贝数多5、容易从宿主细胞中分离纯化

质粒载体必须具备的条件：1、具有复制起点2、具有抗菌素抗性基因3、若干限制酶的单一位点4、具有较小的分子量和较高的拷贝数

质粒的分离：通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌的裂解。1、氯化铯密度梯度离心法2、碱变性法3、微量碱变性法

质粒载体的基本构型：1、共价闭合环状DNA 2、开环DNA 3、线性DNA

表达型质粒载体：主要使外源基因表达出蛋白质产物，如果在大肠杆菌里表达，必须使所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录和翻译之下。

穿梭质粒载体：人工构建的具有两种不同重复起点和选择标记，可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

大肠杆菌表达载体的操纵元件：阻遏基因I ，操纵基因O，启动基因P，核糖体结合位序列，转录终止信号。

质粒载体不稳定的因素：1、结构的不稳定性：DNA 的插入，缺失和重排都会造成质粒载体结构不稳定。

2、分离的不稳定:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。

影响质粒载体稳定性的主要因素：1、新陈代谢负荷a、复制负荷b、转录和翻译负荷2、质粒载体的拷贝数3、寄主菌的重组体系

PCR的原理和特点：原理：类似于DNA的体内复制，首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高，使退火引物在DNA 聚合酶作用下得以延伸，这种变性、复性、延伸的过程，就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。特点：1、灵敏度高2、简便快捷3、对标本的纯度要求低

反向PCR:是用反向互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的位置序列进行扩增。

RT-PCR：是以反转录的cDNA做模板进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已知序列是否发生突变，呈现mRNA多态性，克隆mRNA 5｀和3｀末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。

多重PCR:在一个反应体系中，使用一对以上引物的PCR反应，称为多重PCR。

荧光定量PCR：通过荧光染料火荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件，可以对结果进行分析、计算待测样品的初始模板量。

引物设计的基本原则：1、引物一般在18-30Bp为宜。2、避免引物内部出现出现二级结构、回文结构。3、GC 和AT碱基均匀分布4、避免出现两引物碱基末端互补5、引物3｀末端碱基一般应与DNA严格配对6、引物碱基序列不能与非扩增区有同源性。

PCR产物不正常的原因：1、没有PCR产物 a/TAQ酶失活 b、引物使用错误 c、是否完全解链。2、没有特异性条带 a/退火温度过低，退货延伸时间过长 b/循环次数过多 c/引物与TAQ酶的浓度过高 d/Mg离子浓度过高 3、没有目的条带，出现片状。a/循环次数过多 b/TAQ酶浓度过高 c、引物特异性不强 d/Mg 离子浓度过高

目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。

基因文库：又称DNA文库，是指某个生物的DNA或cDNA片段，与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到的大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合，即为该生物的基因文库。

基因组文库：指将某种生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。这个群体就称为该生物的基因组文库，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。

基因组文库构建的程序：1、载体的制备2、高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的被3、高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离。4、载体与外源片段的链接与转化或侵染宿主细胞。

基因组文库的优点：1、cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列2、cDNA 文库中，不同克隆mRNA的分布状态总是反映着mRNA的分布状态。3、从cDNA 克隆中，不能克隆到基因组DNA中非转录段序列，不能用于研究基因编码区外调控序列的结构与功能。

cDNA文库:指将某种生物基因组转录的全部mRNA，经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称为该生物基因组的cDNA文库。

cDNA文库的构建：1、细胞总RNA的提取和mRNA的分离2、第一条cDNA的合成3、第二条cDNA 合成4、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体。

CDNA文库的优缺点：优点：1、cDNA以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构，研究有关基因的克隆分离。2、cDNA文库的筛选比较简单易行。3、每一个cDNA文库都含有一个mRNA 序列。这样在目的基因的选择中，出现假阳性的概率就会比较小，因此，阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。4、cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用与基因工程操作。5、cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究。缺点：1、包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。2、虽然反应mRNA 分子结构和功能信息，但不能直接识别基因内含子序列序列和编码区外大调控序列的结构和功能方面的信息。3、相应于高丰度的mRNA的cDNA克隆所占的比例较高，分离比较容易，而相对于低丰度的mRNA的cDNA 的克隆所占比例较小，分离比较困难。

图为克隆的原理：图为克隆又称定位克隆，用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用于目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。程序：1、建立目的基因的遗传分离群体2、找到与目的基因紧密连锁的分子标记3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置4、构建含有大插入片段的基因组文库5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库6.用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群7、通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆8、通过亚克隆获得目标的小片段克隆9、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。存在的问题：1、需要有精确的遗传图谱2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还相距甚远3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际