尿蛋白电泳操作规程

尿蛋白电泳操作规程

一．项目名称

尿蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEINURIE）

二．检验方法名称

SDS－琼脂糖凝胶区带电泳

三．方法学原理

在含有多量的阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）液体中，蛋白质可与其连接，形成SDS —蛋白质复合物。这种复合物蛋白本身的构造已经破坏，他们都表现出相同的构造和相同的负电荷。当这种SDS—蛋白质复合物在具有适当筛选功能的介质中电泳时，如在含高浓度琼脂糖的HYDRAGEL 5 PROTEINURIE凝胶上电泳时，蛋白质按它们的分子量大小进行分离。

在HYDRAGEL 5 PROTEINURIE凝胶上能清楚分离来源于肾小管（分子量＜65-70Kda)还是来源于肾小球（分子量＞65-70KDa）的蛋白质，因此尿蛋白不仅能被检测到，而且能对蛋白来源进行分类（肾小球，肾小管性和混合性）。

四．方法学溯源

自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。

五．仪器

（一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210)

（二）分析和计算参数：

1．处理量：约14个样本/小时

2．所需样本量：5ul

3．检验时间：约50分钟

4．重复性：有良好的批内和批间重复性

5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V）

电流0－500mA

功率0－100W

六．试剂及配套品

（一）试剂

1．HYDRAGEL 5 PROTEINURIE试剂盒

（1）商标：SEBIA

（2）包装规格：50测试

（3）货号：PN4115

2．脱色液

（1）商标：SEBIA

（2）包装规格：Pack for 10×100ml

（3）货号：PN4540

（4）成分：柠檬酸

3．洗涤液

（1）商标：SEBIA

（2）包装规格：Pack for 10×80ml

（3）货号：PN4541

（4）成分：叠氮钠

（二）配套品

尿蛋白质控

（1）商标：SEBIA

（2）包装规格：Pack for 5×1ml

（3）货号：PN4781

七．操作步骤

㈠开机，启动电泳仪。

㈡打开密闭的凝胶片盒，取出凝胶片并放在关闭的凝胶片盒上，用滤纸条轻柔、迅速地吸去凝胶片槽孔中的多余水分，在每一槽孔内加入5ul已处理的尿样本，注意不能有气泡，在每次加样前应擦拭移液器尖端，在整个加样过程千万不可触及槽孔的底部。

㈢选择« PROTEINURIA 1*5 »程序进行一个凝胶片的电泳，或者« PROTEINURIA 2*5 »程序进行两个凝胶片的电泳。

㈣取出缓冲条固定在电极架上，当放一个凝胶片时将120ul蒸馏水或去离子水加在电泳舱的温控板上偏下中间处，或者在放两个凝胶片时，在偏下的左半侧和右半侧各加100ul的蒸馏水或去离子水；将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。

㈤自然放下支架，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。

㈥电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束，打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，取出已烘干的胶片，用湿纸巾擦拭电极和温控板，将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查染色液瓶内是否有300ml染色液，脱色液瓶内是否有1000ml脱色液，保存液容器内是否有300ml保存液以及是否排空了废液瓶后，选择«Proteinuria»染色程序并按“start”键开始染色。

㈦在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架并取下已干燥的凝胶片，可用湿软的纸擦干凝胶片背面的塑料支持膜。

㈧关机。

八．参考范围

本试验是定性结果。

九．临床意义

㈠生理性蛋白尿：尿蛋白含量是很低的，通常低于120mg/24h，男女之间无明显差异。主要是白蛋白，有时可有极微量的转铁蛋白或免疫球蛋白，当尿蛋白＞120mg/24h时，应考虑为病理性蛋白。对阳性的尿蛋白（＞120mg/24h）应注意随访。

㈡肾小球型蛋白尿：尿蛋白其特征为：分子量＞65-70KDa（如白蛋白、转铁蛋白和IgG），电泳条带显示位置在样本加样点与白蛋白部分之间，白蛋白是其主要组分。

㈢肾小管型蛋白尿：其蛋白特征为：分子量＜65-70KDa，电泳条带位于白蛋白和凝胶片阳极端之间。如α1－微球蛋白，游离轻链单体，β2－微球蛋白，视黄醇结合蛋白(RBP)，溶菌酶，单纯性肾小管型蛋白尿中白蛋白只占少部分。

㈣混合型蛋白尿：其蛋白特征为肾小管及肾小球的蛋白同时并存。

通过此方法我们可以很容易地对肾脏疾病作早期诊断/鉴别诊断及分型、治疗效果的观察、肾活检（属创伤性诊断）前的筛查、甚至代替肾活检。

十．标本要求

㈠取24小时的新鲜尿液，必要时样品在2℃～8℃可保存一周。冷冻的样本可保存一个月。冷冻样品中加入HEPES 0.1 M (pH 6.75)和叠氮钠0.02g/dl，则可提高保存的稳定性。勿用硼酸做为防腐剂。解冻后样本可产生蛋白变性导致的细小点样痕迹。

㈡取20ul稀释液（这种液体很粘稠，吸管取时要保持垂直，慢慢吸，保证无气泡），放入小试管底部，保证粘稠液体不粘在管壁上，加80ul纯尿液，旋涡混匀5秒钟。

如果尿蛋白＞0.2g/dl，则尿液先用盐水稀释至0.2g/dl左右，然后再按下列标准程序操作。注意：混浊的尿样本（未稀释的或浓缩的）点样后很难渗透到点样器的末端，建议使用离心法（例如：3000转数/分，10分钟）或者过滤法（例如：0.45um孔径滤过器）来除去杂质微粒。

十一. 操作注意事项

㈠为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡用滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。㈢注意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。