乳铁蛋白的分离和纯化培训课件
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乳铁蛋白的分离与纯化
亲合色谱法
不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，
基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一
定长度的可以连接基质的有机物 例如，肝素琼脂糖亲合色谱 能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且 经电泳分析表明其纯度极高。
例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚
亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈 蓝色, 装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直 接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0-2.8 浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度 0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来 说,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和 免疫球蛋白,并且产品的纯度极高。
色谱法 ----吸附色谱法
是利用的。疏 水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分 离上有重要的应用。一般以Toyopearl 为基质,在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平 衡后再装柱,用去离子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脱,得纯度为 80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比 较小,效率比较低.
于蕾
乳铁蛋白的价值
乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道
细胞对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒， 抗氧化，抗癌，调节机体免疫反应等多种功 能，并己广泛应用于食品，畜牧等行业。 LF 可耐受较高温 度,使之在 饲料加工过程 中不易变性失活，它促进铁的转运和吸收, 可以治疗仔猪贫血。它具有广谱的抗菌，抗 病毒作用,可用来预 防和 治疗仔 猪 腹泻:它 具有调节免疫系统活性的作用，增强家畜对 疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂质氧化 作用,可用作防霉剂和抗 氧化剂。
超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是
根据膜孔径不同可以实现不同分子质 量和分子形状的大分子物质的分离， 非常适合热敏性的功能性组分的分离。 选用孔径或截留分子量不同的一系列 超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产 Lf基料。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
乳铁蛋白培训ppt课件
NBL天然营养食品（新西兰）有限公司
纽宾乐国际贸易（上海）有限公司
什么是乳铁蛋白
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一种重要的非血红 素铁结合糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，最初 由Sorensen等于1939年在动物乳中发现，并由Groves首先 从牛乳中分离获得，因与铁结合形成的复合物呈红色，故 称之为“红蛋白”。1961年，从人乳中分离获得的此种蛋 白正式命名为乳铁蛋白。
适用人群
乳铁蛋白对婴幼儿的作用：
二、乳铁蛋白帮助宝宝补铁补血，促进造血功能，防止并减少缺铁性贫血的 发生 乳铁蛋白是我们体内勤快的搬运工，是体内唯一运载铁离子的蛋白质 。 目前，我国儿童和青少年缺铁性贫血发生率很高，国内很多媒体都有相关报 道。日常喂养和饮食中缺少乳铁蛋白是一个主要的因素之一。
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适用人群
乳铁蛋白认知程度不高的原因：
原因一：乳铁蛋白是最近几年才实现规模化生产；
原因二：我国是发展中国家，在营养的研究和应用领域落后于发达国家；
原因三：我国卫生部2004年出台国家标准和法规，推广乳铁蛋白应用。
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适用人群
缺铁性贫血者
• 乳铁蛋白能高效促进铁吸收， 临床试验证明，铁与乳铁蛋白 结合后吸收率是单纯补铁的4 倍。缺铁性贫血者在补铁时配 合摄入乳铁蛋白，可达到减少 铁制剂摄入量，增强补铁效果 的作用，同时，由于乳铁蛋白 的摄入，还可以明显缓解铁对 肠道的刺激。
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乳铁蛋白PPT ppt课件
Page 5
来源
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乳铁蛋白主要是 从牛奶中提取
Page 6
1kg鲜牛奶仅能提取 2-4mg乳铁蛋白， 提取比例为出约
1/25000-50000
2、乳铁蛋白的生理功能及原理
LOGO
Page 7
1、抗-菌、病毒、寄生虫的作用及原理
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——夺铁
1.铁离子是几乎所有 细菌生长所必需的物 质（是细菌生物氧化
60
50
甲
40
乙
30
20
10
小时
0
3
6
9
12
结论
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如果乳铁蛋白铁含量低，将更有效的吸收细菌中的铁从而起到阻止细菌生长的
作用.
如果乳铁蛋白铁饱和度低，将更有效的吸收细菌中的铁从而起到阻止细菌生长
的作用.
因此，乳铁蛋白的低铁含量，低饱和度，高含量将更有效的吸收细菌中的铁
铁的饱和度
介质的作用
pH的影响
介质以血液为 好，盐汁为差
3、影响乳铁蛋白活性的因素
LOGO
乳铁蛋白随着 含铁量的增加 其活性降低
饱和度小于10%
缺铁型
半饱和型
饱和度12%—15%
饱和型
饱和度大于15%
Page 25
实验
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1、两个相同的培养基（甲、乙）加入15个大肠杆菌 少量的Fe3+(1 毫克)每次观察间隔时间为3个小时
Page 15
实验3
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将100条金鱼预先用添加 0.4％ LF的饵料分别饲喂 3天和 14天，再和患白斑病的金鱼一起用普通饵料饲喂10天 。 （ 金鱼各100条）
条数 80
70 60 50 40 30 20 10
蛋白质分离纯化技术ppt课件
.
10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
.
24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》
《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》一、引言牛初乳因其含有丰富的营养成分，尤其是乳铁蛋白等生物活性物质，具有极高的营养价值和医疗保健作用，近年来备受关注。
乳铁蛋白作为一种重要的生物活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化的作用，对于提高人体免疫力、促进生长发育等方面具有重要作用。
因此，对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究具有重要的实际意义和应用价值。
二、材料与方法2.1 材料牛初乳、盐、乙醇、硫酸铵等化学试剂。
2.2 方法（1）牛初乳的收集与预处理选择健康的母牛，在分娩后3天内收集初乳。
经过初步的过滤和消毒处理后，进行后续的乳铁蛋白提取实验。
（2）乳铁蛋白的提取采用不同的提取方法，如盐析法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法等，对牛初乳中的乳铁蛋白进行提取。
通过比较各种方法的提取效果，选择最佳的提取方法。
（3）乳铁蛋白的分离纯化采用透析、超滤、凝胶过滤等方法对提取得到的乳铁蛋白进行分离纯化。
通过SDS-PAGE电泳、紫外可见光谱等方法检测纯化效果，确定最佳的分离纯化工艺。
三、结果与分析3.1 乳铁蛋白的提取结果通过比较不同提取方法的效果，发现硫酸铵沉淀法在牛初乳中乳铁蛋白的提取效果最佳。
在一定的硫酸铵浓度和温度条件下，可以有效地将乳铁蛋白从牛初乳中沉淀出来。
3.2 乳铁蛋白的分离纯化结果通过透析、超滤、凝胶过滤等方法的组合应用，可以有效地将乳铁蛋白从其他杂质中分离出来，并达到较高的纯度。
SDS-PAGE电泳和紫外可见光谱检测结果表明，经过分离纯化后的乳铁蛋白具有较高的纯度，且分子量与标准品一致。
3.3 工艺参数优化通过对工艺参数的优化，如硫酸铵浓度、沉淀时间、透析时间等，可以进一步提高乳铁蛋白的提取率和纯度。
同时，通过对不同批次牛初乳的试验，验证了该工艺的稳定性和可靠性。
四、讨论本研究通过对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究，发现硫酸铵沉淀法结合透析、超滤、凝胶过滤等方法可以有效地提取和纯化牛初乳中的乳铁蛋白。
乳铁蛋白课堂PPT
图4为峰4洗脱液经RP-HPLC检测结果。结果显示牛初乳经除脂肪、除酪蛋白、 超滤和离子交换层析后，提取的乳铁蛋白的平均纯度为92.23%，RSD为1.3%。
24
乳铁蛋白的应用
作为一种高效补铁组分，Lf可用作食品添加剂，以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现 状 ， 也可制成含铁饮料或补铁胶囊，用来提高造血功能，改善贫血。
17
18
影 响 Lf 功 能 的 因 素
Lf只有在维持其活性不被降解的前提下，才能发挥生理功能。
实验证明，婴儿或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，随后迅速升高，生理功能也逐 渐消失。
Lf的抑菌作用具有很强的铁依赖性，只有在其处于不饱和状态时，才具有较强的抑 菌能力，而在Lf呈铁饱和状态时，抑菌作用也不复存在。
定义
乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一个大约有700个氨基酸残基构成的、
分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细 胞表达和分泌。 因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。
乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节 免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发 潜力的食品和饲料添加剂。
豆油粉末的保质期。 总之，Lf因其具有多种生理活性功能，在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域
已得到广泛应用，其开发前景不可限量
25
感谢您的关注！
26
样品溶液的制备 量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH值至4.6，离心除酪蛋白， 收集乳清，然后调pH值至6.8，加硫酸铵使饱和度达到40%，离心取乳清 液，用截留分子量为300Ku、100Ku、30Ku的超滤膜包进行超滤，收集 30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析，收集洗脱峰，即为样品溶液。
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乳铁蛋白的应用
作为一种高效补铁组分，Lf可用作食品添加剂，以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现 状 ， 也可制成含铁饮料或补铁胶囊，用来提高造血功能，改善贫血。
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影 响 Lf 功 能 的 因 素
Lf只有在维持其活性不被降解的前提下，才能发挥生理功能。
实验证明，婴儿或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，随后迅速升高，生理功能也逐 渐消失。
Lf的抑菌作用具有很强的铁依赖性，只有在其处于不饱和状态时，才具有较强的抑 菌能力，而在Lf呈铁饱和状态时，抑菌作用也不复存在。
定义
乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一个大约有700个氨基酸残基构成的、
分子量约为80KDa的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族，主要由乳腺上皮细 胞表达和分泌。 因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。
乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节 免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发 潜力的食品和饲料添加剂。
豆油粉末的保质期。 总之，Lf因其具有多种生理活性功能，在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域
已得到广泛应用，其开发前景不可限量
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感谢您的关注！
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样品溶液的制备 量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH值至4.6，离心除酪蛋白， 收集乳清，然后调pH值至6.8，加硫酸铵使饱和度达到40%，离心取乳清 液，用截留分子量为300Ku、100Ku、30Ku的超滤膜包进行超滤，收集 30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析，收集洗脱峰，即为样品溶液。
乳铁蛋白内部培训
乳铁蛋白及其蛋白降解产物——乳铁蛋白肽(Lactoferricin Lfcin)具有广 泛的生物学活性，包括广谱抗菌作用、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机 体免疫反应等，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品、 化妆品和饲料添加剂，美国食品药品管理局早已允许乳铁蛋白作为食品添 加剂用于运动、功能性食品。
分布与含量
乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精 液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞）；人乳中乳铁蛋白浓度约为 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.0～3. 2mg/ml，是牛乳的10倍(牛乳中含量为0.02～0. 35mg/ml)，其含量仅次于酪蛋 白，占普通母乳总蛋白的20%。
乳 铁 蛋 白 简 介
乳铁蛋白经酸性蛋白酶降解后，其抗菌活性比完整乳铁蛋白高出20倍， 并能从此降解产物中分离出比乳铁蛋白抗菌活性高400多倍的多肽，即乳铁蛋 白肽(Lfcin),具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，同 时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功
蛋 白 的 功 能
乳 铁 蛋 白 简 介
4
三、乳铁蛋白分类
根据乳铁蛋白结合铁Fe3+的情况，可将其分为缺铁型乳铁蛋白(apoLF)，C端单铁 型乳铁蛋白(FeC-LF)，N端单铁型乳铁蛋白( FeN-LF)和铁饱和型乳铁蛋白(HoIoLF)四种类 型。其中C端单铁型乳铁蛋白( FeC-LF)和N端单铁型乳铁蛋白(FeN-LF)统称为半饱和型乳 铁蛋白。
乳铁蛋白肽是乳铁蛋白经胃蛋白酶水解后可得到的具有抗菌能力的活性多肽，目 前多肽主要有以下几种：
1、具有强力抗菌效果的多肽，其抗菌活性是乳铁蛋白的400多倍。 2、抗真菌活性多肽。 3、促进细胞增长（或繁殖）的多肽。 4、抗肿瘤活性肽及其他生理功能活性肽。
分布与含量
乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精 液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞）；人乳中乳铁蛋白浓度约为 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.0～3. 2mg/ml，是牛乳的10倍(牛乳中含量为0.02～0. 35mg/ml)，其含量仅次于酪蛋 白，占普通母乳总蛋白的20%。
乳 铁 蛋 白 简 介
乳铁蛋白经酸性蛋白酶降解后，其抗菌活性比完整乳铁蛋白高出20倍， 并能从此降解产物中分离出比乳铁蛋白抗菌活性高400多倍的多肽，即乳铁蛋 白肽(Lfcin),具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，同 时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功
蛋 白 的 功 能
乳 铁 蛋 白 简 介
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三、乳铁蛋白分类
根据乳铁蛋白结合铁Fe3+的情况，可将其分为缺铁型乳铁蛋白(apoLF)，C端单铁 型乳铁蛋白(FeC-LF)，N端单铁型乳铁蛋白( FeN-LF)和铁饱和型乳铁蛋白(HoIoLF)四种类 型。其中C端单铁型乳铁蛋白( FeC-LF)和N端单铁型乳铁蛋白(FeN-LF)统称为半饱和型乳 铁蛋白。
乳铁蛋白肽是乳铁蛋白经胃蛋白酶水解后可得到的具有抗菌能力的活性多肽，目 前多肽主要有以下几种：
1、具有强力抗菌效果的多肽，其抗菌活性是乳铁蛋白的400多倍。 2、抗真菌活性多肽。 3、促进细胞增长（或繁殖）的多肽。 4、抗肿瘤活性肽及其他生理功能活性肽。
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乳铁蛋白的分离和纯化
2
自 1960年以来人们就试着采用各种方 法来制备LF如
离子交换层析色谱,超滤,固定化单克隆 抗体,亲和层析等从人乳或牛乳中分离 纯化 LF，但色谱法和固定化单克隆抗 体法虽能获得较高纯度的 LF但价格昂 贵技术要求高,所以并不适用于工业化 生产.
超滤法简便费用低,易形成 工业化生产 ，但 LF 纯度低膜需要经常清洗。
乳铁蛋白的分离和纯化
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亲合色谱法
不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体， 基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一
定长度的可以连接基质的有机物 例如，肝素琼脂糖亲合色谱 能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且
经电泳分析表明其纯度极高。
乳铁蛋白的分离和纯化
6
例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚 亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈 蓝色,
85%的饱和硫酸铵沉淀30min。
此时需在PH8.5的情况下，4℃4000r/min, 离心40min。
此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。
乳铁蛋白的分离和纯化
12
凝胶层析：
为了获得较高纯度的LF，选用
sephadex-G-100 对LF进行分离和纯化 。
将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶 层析柱，在20℃条件下以0.2mL/min的 流速 进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的 PBs（Nacl含量 8g/1000mL)，待出现 峰值后收集洗脱液，每管收集lmL。
溶液在400-650nm
下扫描，发现在475nm波长产生特征吸
收峰(见图3)于475nm测定其吸光度,作
出浓度C与吸光度A之间关系的线性回
归方程,如图四,得方程为
峰峰值较大,说明LF含量较高,但是样品不纯,含有
其他成分,经SDS-PAGE电泳检测结果为峰2样品中含
有两种成分,峰3样品中含有三种成分。峰IV则说明
样品的各个成分含量都很低,经SDS-PAGE 电泳检测
可见条带非常乳不铁蛋白清的分晰离和.纯化
15
分光光度法
采用分光光度法测
定LF浓度,首先利
用纯度为92%的LF
乳铁蛋白的分离和纯化
13
LF 的鉴 定
采用非连续性SDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析 分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产 物进行检测。
采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋 白的浓度进行测定。
乳铁蛋白的分离和纯化
14
结果与分析
由于LF的pH为7.0-8.0,所以本
试验凝胶层析选用的洗脱液为
乳铁蛋白的分离和纯化
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超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是 根据膜孔径不同可以实现不同分子质 量和分子形状的大分子物质的分离， 非常适合热敏性的功能性组分的分离 。选用孔径或截留分子量不同的一系 列超滤膜，可以以干酪乳清为原料生 产 Lf基料。
乳铁蛋白的分离和纯化
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盐析法 和层析法
从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用 电泳和分光光度法检测其纯度和含量 所获得的乳铁蛋白的分子质量为 90000u,纯度大约为92%。采用3次盐析 和1次凝胶层析的方法。
乳铁蛋白的分离和纯化
3
离子吸附法
1 最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯 化得到较纯的Lf.
2 磷酸纤维素交换色谱法
羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于Lf和乳 过氧化氢酶的分离纯化,
用pH值7.7,浓度0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓 度0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱,它可 将Lf的a,b两种变异体分离出来,而且树脂能用 浓度0.2mol/L的NaOH溶液和浓度0.2mol/L的 HCI溶液再生,此法相对来说要更有效
乳铁蛋白的分离和纯化
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盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小 的蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀 30min后，4℃条件4000r/min离40min;
将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉 30min后,4℃条件下4000r/min离心40min， 除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用
装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直 接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0-2.8 浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度 0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来说 ,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和免 疫球蛋白,并且产品的纯度极高。
乳铁蛋白的分离和纯化
乳铁蛋白的分离和纯化
乳铁蛋白LF ,是存在于哺乳动物外分泌液中 的一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋 白相 似，但铁结合能力是转铁蛋白的 260 倍， LF是由689个氨基酸组成的单一多链分子。 每个分子中有2个金属结合位点，每个位点 可结合一个Fe3+和一个HCO3-或CO3。Lf 的铁 结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高 浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而 在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合 能力则减弱。
pH7.4的PBS，在这个pH范围内
均可以得到LF。由图1可知峰l
显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但
是非LF成分SDS-PAGE电泳检测仅出现一条可见的区带,相对
分子质量为9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分
析LF的纯度达 到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收
乳铁蛋白的分离和纯化
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试验方 法
乳样前期处理：
乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去 脂 肪和大量的酪蛋白,
物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离 心脱去脂肪(4℃，3000r/min、30min)得到脱脂乳， 将脱脂乳稀释后， 边搅拌边向其中加入 1mol/L 盐 酸溶液调整脱脂乳的 pH 值到 4.6(酪蛋白的等电点) ，室温放置 30min，离心除去酪蛋白(4℃、 10000r/min、30min)，得到的上清就是我们需要的乳 清，用它来分离 Lf
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固定化单克隆抗体法
利用抗原-抗体之间的高特异性结合 在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进
行免疫,经一系列操作分离出抗体,用抗体和 异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色 谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液, 用洗脱 0.2 mol/L pH2.7醋酸缓冲液(含0.1 5mol/L NaCl)洗脱。 ----成本贵