乳铁蛋白基因的获取

摘要：本实验通过基因工程的方法进行编码目的基因的DNA的制备，主要通过以下形式：真核生物mRNA的获取、表达乳铁蛋白的mRNA获取纯化、通过mRNA反转录cDNA等一系列步骤完成。

关键字：目的基因获取基因工程乳铁蛋白

cDNA的制备PCR技术

目录

一、实验目的 (2)

二、真核生物组织中获取基因简介 (2)

三、RNA的获取 (3)

四、相应DNA的获取处理 (4)

五、获取编码目的基因的mRNA方法·4

六、cDNA获取 (5)

七、心得体会 (6)

八、参考文献 (6)

RT-PCR法获取人乳铁蛋白基因

一、实验目的

乳铁蛋白出现在动物乳，特别是初乳中，为婴幼儿提供多种生物功能，尤其是调节免疫和对病原微生物的抵御功能。乳铁蛋白是从牛乳中提取的一种安全可靠的天然物质，其在食品方面的应用已得到许多国家和地区法律的承认。随着乳铁蛋白作用机制的不断阐明和开发应用范围的扩大，乳铁蛋白在疾病防治、营养补充、食品和药品防腐、化妆品等方面有广阔的应用前途。基于众多的研究成果和试验，在婴幼儿配方食品中添加乳铁蛋白带来重大意义。在婴幼儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，既可满足婴儿生长发育的需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。目前在全球的农业发达国家像新西兰、瑞士、澳大利亚、荷兰等，不仅拥有着全球最优质的奶源，而且，更加注重免疫、吸收等功能效果。在这些国家的高端婴幼儿配方奶粉当中，多数有添加乳铁蛋白这一重要的母乳成分，例如瑞士百立乐金装婴幼儿配方奶粉、美素奶粉等。

应用人群

1.孕产妇：孕产妇补充乳铁蛋白，可以提高其抵抗力，有效预防或治疗孕期、哺乳期的细菌、病毒性感染；同时，促进铁吸收，预防孕产妇贫血。

2.非母乳喂养、混合喂养的婴幼儿：乳铁蛋白是母乳中的核心免疫蛋白，能帮助婴幼儿抵抗细菌、病毒等有害微生物，预防病毒引起的呼吸道感染及腹泻等婴儿常见疾病；同时还可以促进婴儿的生长发育和增强造血功能，为婴儿构筑起健康成长的第一道防线，“吃母乳的宝宝少生病”正是这个道理。遗憾的是，目前市场上的婴幼儿配方奶粉中很少有添加乳铁蛋白的产品，这也是配方奶粉与母乳的最本质区别。因此，对非母乳喂养儿、混合喂养儿，食用配方奶粉的同时，额外补充乳铁蛋白，可以大大改善配方奶粉的不足，使其营养成分更趋向于母乳！

3.缺铁性贫血者：乳铁蛋白能高效促进铁吸收，临床试验证明，铁与乳铁蛋白结合后吸收率是单纯补铁的4倍。缺铁性贫血者在补铁时配合摄入乳铁蛋白，可达到减少铁制剂摄入量，增强补铁效果的作用，同时，由于乳铁蛋白的摄入，还可以明显缓解铁对肠道的刺激。

4.免疫力低下者：体弱多病者大多抵抗力低下，乳铁蛋白能够帮助他们激发、建立、修复、完善免疫系统，增强抗病能力。

人体实验

1.有助于肠道比菲德氏菌的繁殖。

2.除了干扰素外，乳铁蛋白是第一个被发现具有抗C型肝炎的活性物质，可以减少血浆中HCV-RNA值（其值可作为C型肝炎病毒活性高低的评估）。

3.减少导致胃溃疡重要原因幽门螺旋杆菌

H.pylori的数目

二、真核生物中基因获取方法简介

目的基因制取策略有直接获取和间接获取。对于一些低等的生物一般用直接法，而像人这样的高等动物，基因组比较复杂，而且还没有研究清楚，所以一般用间接获取法。常用的有人工合成法，逆转录PCR法，构建基因文库法等。其中以逆转录PCR（RT-PCR）法最常用。

逆转录PCR（RT-PCR）的基本步骤如下：

1，总RNA的提取

2，mRNA的纯化

3，第一链cDNA的合成

4，PCR扩增

三、RNA的获取

实验方案：用氯化锂－尿素从乳房组织中分离RNA。此法成功的关键：组织匀浆时间短，能够在一分钟内完成。这期间将试管浸没在冰水中。

1、实验前所有缓冲液和试管必须预冷到4℃，保证核酸酶的活性最低

2、将称量盘置于干冰上放置数分钟，使组织样品没有融合就可以精确称量

3、将适当重量的组织迅速转移到预冷的50ml锥形瓶中，加入10倍体积的氯化锂缓冲液

4、把锥形瓶置于冰水浴中，用Polytron匀浆器匀浆，总时间不超过一分钟。

5、把匀浆液转移到预冷的15ml聚丙烯锥形管中。将装有匀浆液的试管－20摄氏度过夜。

6、第二天早晨，将管子置于离心机的转子内，以5000×g于4离℃心75分钟。

7、离心后，倒出上清液，用无尘纸吸干离心管的溶液。

8、每管加入8～10ml冷的3mol/L氯化锂，涡旋半分钟。

9、样品以5000×g于4离心℃45min。

10、重复步骤6~8。

11、将沉淀重新悬浮于2.5mlTE缓冲液或SDS缓冲液（10mmol/Ltris，0.1mmol/LEDTA，0.5%SDS）中。

12、加入150微升5mol/L氯化钠，温和涡旋混匀。

13、如果第一步的材料是装在15ml聚丙烯塑料管中，加入等体积修改后的酚。否则必须将其转移到离心管中。然后小心涡旋将其混匀。（修改后的酚缓冲液是等体积的Tris—SDS缓冲液（100mmol/T氯化钠，1mmol/TEDTA，10mmol/LTris，0.5%SDS））

14、与4℃1000×g离心10min。

15、将上层水样移至新的聚丙烯塑料管中。

16、水相中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，小心涡旋混匀。

17、于4 ℃1000×g离心10min。

18、将上层水相移动到新的聚丙烯塑料管中，如果有蛋白质界面，切勿转移界面。

19、最后用等体积氯仿：异丙醇（24;1)抽提一次。于4℃以1000×g 离心样品3min。

20、将上层水相移至已经在冰上预冷的不含RNased的玻璃管中，加入3倍体积的100%乙醇。

21、将玻璃管置于-20℃℃过夜，最大量的回收RNA。

22、将玻璃管置于橡皮套管中，置于预冷的离心机转子中于4℃9000×g离心30min。

23、离心结束后，小心倒出上清液。