乳铁蛋白基因的获取

摘要：本实验通过基因工程的方法进行编码目的基因的DNA的制备，主要通过以下形式：真核生物mRNA的获取、表达乳铁蛋白的mRNA获取纯化、通过mRNA反转录cDNA等一系列步骤完成。

关键字：目的基因获取基因工程乳铁蛋白
cDNA的制备PCR技术
目录
一、实验目的 (2)
二、真核生物组织中获取基因简介 (2)
三、RNA的获取 (3)
四、相应DNA的获取处理 (4)
五、获取编码目的基因的mRNA方法·4
六、cDNA获取 (5)
七、心得体会 (6)
八、参考文献 (6)
RT-PCR法获取人乳铁蛋白基因
一、实验目的
乳铁蛋白出现在动物乳，特别是初乳中，为婴幼儿提供多种生物功能，尤其是调节免疫和对病原微生物的抵御功能。

乳铁蛋白是从牛乳中提取的一种安全可靠的天然物质，其在食品方面的应用已得到许多国家和地区法律的承认。

随着乳铁蛋白作用机制的不断阐明和开发应用范围的扩大，乳铁蛋白在疾病防治、营养补充、食品和药品防腐、化妆品等方面有广阔的应用前途。

基于众多的研究成果和试验，在婴幼儿配方食品中添加乳铁蛋白带来重大意义。

在婴幼儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，既可满足婴儿生长发育的需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。

目前在全球的农业发达国家像新西兰、瑞士、澳大利亚、荷兰等，不仅拥有着全球最优质的奶源，而且，更加注重免疫、吸收等功能效果。

在这些国家的高端婴幼儿配方奶粉当中，多数有添加乳铁蛋白这一重要的母乳成分，例如瑞士百立乐金装婴幼儿配方奶粉、美素奶粉等。

应用人群
1.孕产妇：孕产妇补充乳铁蛋白，可以提高其抵抗力，有效预防或治疗孕期、哺乳期的细菌、病毒性感染；同时，促进铁吸收，预防孕产妇贫血。

2.非母乳喂养、混合喂养的婴幼儿：乳铁蛋白是母乳中的核心免疫蛋白，能帮助婴幼儿抵抗细菌、病毒等有害微生物，预防病毒引起的呼吸道感染及腹泻等婴儿常见疾病；同时还可以促进婴儿的生长发育和增强造血功能，为婴儿构筑起健康成长的第一道防线，“吃母乳的宝宝少生病”正是这个道理。

遗憾的是，目前市场上的婴幼儿配方奶粉中很少有添加乳铁蛋白的产品，这也是配方奶粉与母乳的最本质区别。

因此，对非母乳喂养儿、混合喂养儿，食用配方奶粉的同时，额外补充乳铁蛋白，可以大大改善配方奶粉的不足，使其营养成分更趋向于母乳！
3.缺铁性贫血者：乳铁蛋白能高效促进铁吸收，临床试验证明，铁与乳铁蛋白结合后吸收率是单纯补铁的4倍。

缺铁性贫血者在补铁时配合摄入乳铁蛋白，可达到减少铁制剂摄入量，增强补铁效果的作用，同时，由于乳铁蛋白的摄入，还可以明显缓解铁对肠道的刺激。

4.免疫力低下者：体弱多病者大多抵抗力低下，乳铁蛋白能够帮助他们激发、建立、修复、完善免疫系统，增强抗病能力。

人体实验
1.有助于肠道比菲德氏菌的繁殖。

2.除了干扰素外，乳铁蛋白是第一个被发现具有抗C型肝炎的活性物质，可以减少血浆中HCV-RNA值（其值可作为C型肝炎病毒活性高低的评估）。

3.减少导致胃溃疡重要原因幽门螺旋杆菌
H.pylori的数目
二、真核生物中基因获取方法简介
目的基因制取策略有直接获取和间接获取。

对于一些低等的生物一般用直接法，而像人这样的高等动物，基因组比较复杂，而且还没有研究清楚，所以一般用间接获取法。

常用的有人工合成法，逆转录PCR法，构建基因文库法等。

其中以逆转录PCR（RT-PCR）法最常用。

逆转录PCR（RT-PCR）的基本步骤如下：
1，总RNA的提取
2，mRNA的纯化
3，第一链cDNA的合成
4，PCR扩增
三、RNA的获取
实验方案：用氯化锂－尿素从乳房组织中分离RNA。

此法成功的关键：组织匀浆时间短，能够在一分钟内完成。

这期间将试管浸没在冰水中。

1、实验前所有缓冲液和试管必须预冷到4℃，保证核酸酶的活性最低
2、将称量盘置于干冰上放置数分钟，使组织样品没有融合就可以精确称量
3、将适当重量的组织迅速转移到预冷的50ml锥形瓶中，加入10倍体积的氯化锂缓冲液
4、把锥形瓶置于冰水浴中，用Polytron匀浆器匀浆，总时间不超过一分钟。

5、把匀浆液转移到预冷的15ml聚丙烯锥形管中。

将装有匀浆液的试管－20摄氏度过夜。

6、第二天早晨，将管子置于离心机的转子内，以5000×g于4离℃心75分钟。

7、离心后，倒出上清液，用无尘纸吸干离心管的溶液。

8、每管加入8～10ml冷的3mol/L氯化锂，涡旋半分钟。

9、样品以5000×g于4离心℃45min。

10、重复步骤6~8。

11、将沉淀重新悬浮于2.5mlTE缓冲液或SDS缓冲液（10mmol/Ltris，0.1mmol/LEDTA，0.5%SDS）中。

12、加入150微升5mol/L氯化钠，温和涡旋混匀。

13、如果第一步的材料是装在15ml聚丙烯塑料管中，加入等体积修改后的酚。

否则必须将其转移到离心管中。

然后小心涡旋将其混匀。

（修改后的酚缓冲液是等体积的Tris—SDS缓冲液（100mmol/T氯化钠，1mmol/TEDTA，10mmol/LTris，0.5%SDS））
14、与4℃1000×g离心10min。

15、将上层水样移至新的聚丙烯塑料管中。

16、水相中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，小心涡旋混匀。

17、于4 ℃1000×g离心10min。

18、将上层水相移动到新的聚丙烯塑料管中，如果有蛋白质界面，切勿转移界面。

19、最后用等体积氯仿：异丙醇（24;1)抽提一次。

于4℃以1000×g 离心样品3min。

20、将上层水相移至已经在冰上预冷的不含RNased的玻璃管中，加入3倍体积的100%乙醇。

21、将玻璃管置于-20℃℃过夜，最大量的回收RNA。

22、将玻璃管置于橡皮套管中，置于预冷的离心机转子中于4℃9000×g离心30min。

23、离心结束后，小心倒出上清液。

24、用75%乙醇，25%25无RNase的水洗涤RNA沉淀。

温和涡旋玻璃管，于4℃9000×g离心15min。

25、重复步骤22~24俩次，总共洗涤3次。

26、用5ml无水乙醇再洗涤RNA沉淀一次，温和涡旋于4℃以9000×g离心10min。

27、在空气中干燥玻璃管中的RNA沉淀。

但不可以干燥的太彻底。

28、尽可能用最少体积的无菌水或TE缓冲液（10mmol/L Tris,PH 7.5,0.1mmol/LEDTA
）悬浮RNA。

29、取1微升RNA溶液，用分光光度计测量RNA溶液浓度。

然后用适量的RNA溶液上变性琼脂凝胶，根据电泳结果判断分离RNA的样品。

30、RNA溶液分装，置于-80℃。

四、编码目的基因的mRNA获取
（一）、实验方案;用磁珠纯化mRNA
（1）、从总的RNA中分离mRNA。

1）、75微升总的RNA估计含有1~4微克的mRNA。

将总的RNA 溶解于100微升不含RNase的水或ＴＥ缓冲液中。

如果ＲＮＡ样品的浓度低于７５ｕｇ/１００ｕｌ，加入等体积的２×结合缓冲液（１ｍｏｌ/ＬＬＩｃｌ，２０ｍｍｏｌ/Ｌｔｒｉｓ－ｃｌ，ＰＨ７．５，２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ）2）、在６５℃加热ＲＮＡ溶液２ｍｉｎ。

3）、当样品加热变性时，从重悬的储备液中取出１ｍｇＤｙｎａｂｅａｄｓｏｌｉｇｏ（ｄｔ）２５并转移到不含有ＲＮａｓｅ的微型离心管中。

将离心管置于磁铁架。

３０ｓ后再离心管依然置于磁铁架时用微型移液管彻底除去上清液。

（２）、磁珠纯化ｍＲＮＡ
１）、将１００ｕｌ２×结合缓冲液加入到含有磁珠的微型离心管中，同样，在离心管置于磁铁架时彻底除去上清液。

２）、从磁铁架取出离心管，放在微型离心管架上。

将１００ｕｌ２×结合缓冲液加入到磁珠中，轻轻弹动磁珠重悬，如果ＲＮＡ样品在第一步开始时已经在结合缓冲液中稀释，这一步就不必加结合缓冲液了。

3）、将热变性ＲＮＡ加入磁珠悬浮缓冲液中，温和混合。

在室温下杂交５ｍｉｎ。

然后进行ＲＮＡ回收。

以备下步用。

五、获取表达乳铁蛋白的mRNA
一、实验方案：S1核酸酶保护法定量测定特定的mRNA
（一）、基本原理：核酸酶保护实验是定量特异转录产物非常灵敏和精确的方法。

在这种方法中探针和靶RNA间的杂交是在高严谨度条件下的溶液杂交的方式进行的。

杂交反应产物随后用一种单链特异的核酸酶消化，这种核酸酶一般没有双链分子的亲和力。

因此，任何未掺入双链的分子都会被降解，最终被保护的片段可以用乙醇沉淀回收。

（二）、实验步骤
1、戴手套。

整个实验过程都要使用无RNase的材料、试剂、技术。

2、在一个微量离心管中，混合20~30ug的细胞RNA和足量的载体RNA，是总量达到100ug，加入大约1×106cpm的探针（该探针可以用化学合成法合成，也可以体外转录，在此不详细说明）。

用二乙醇基焦炭酸酯处理的水
吧反应体积调到100ug。

一定要准备一个只含有载体RNA和探针的负对照，负对照应该没有保护片段。

3、加入11ug 、PH5.2、3mol/L乙醇钠和250ug冰冷的95%的乙醇共沉淀样品。

载体和探针。

-20℃过夜。

4、离心收集沉淀。

弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤。

弃乙醇，倒置离心管晾干沉淀。

5、沉淀重新溶于20ugS1杂交缓冲液中（80%新鲜的去离子甲醛胺，40mmol/LPIPES，PH 6.4,400mmol/LNacl，1mmol/LEDTA,PH 8.0）。

上下吸吹样品至少20次，确保完全溶解。

6/85℃水浴加热RNA样品10min，使其完全变性。

6、快速离心5s将杂交混合物收集到管底。

把离心管立刻置于预热好的50℃水浴保温3h。

7、用160ugDEPC处理的水稀释反应混合液。

加入20ug10×的随S1核酸酶买来的缓冲液。

8、加入足够的S1核酸酶到酶的终止浓度为200~400u/ml。

9、短暂离心将所有液体收集到管底，37摄氏度温浴1h。

抽提反应物
10、用等体积的酚：氯仿：异丙醇（25:24:1）抽提反应物。

最高离心速度离心2min分层。

11、小心地把水相（上层）转移到一个新的离心管中。

加入1ul 20mg/ml 的糖原。

加入2.5倍体积95%乙醇，沉淀在核酸酶消化反应中被保护的杂交分子。

12、将离心管在干冰上放置15min。

13、离心收集沉淀。

以备下步用。

六、cDNA的获取
（一）、ＡＭＶ催化的cDNA的第一链的合成
1、准备混合反应液1
组分每个反应的量
水5ul
dNTP（10mmol/L）1ul
随机引物（1.0ug/ul）1ul
Oligo（dT）1ul
2、将8ul混合反应液1加到反应罐中。

3、加2ulRNA。

4、反应管70℃加热5min，冰上放置2min。

这步使RNA变性。

5、准备混合反应液2
组分每个反应的量
水2ul
10×第一链反应液1ul
RNasin（20ug/ul）1ul
AMV反转录酶（20ug/ul）1ul
6、将10ul的混合液2加到变性RNA的管中。

7、2℃5温育5min。

8、37或42℃温育60min。

9、样品在99摄氏度加热5min灭活反转录酶。

（二）、PCR反应扩增cDNA
1、购买PCR试剂，用来制备PCR总反应液。

通常要制备50ul的反应体系：取5ul10×PCR缓冲液，3ul25mmol/LMgcl2，终浓度为0.1umol/L的上游引物，终浓度为0.1umol/L的下游引物，0.5ulTaqNDA聚合酶，加水至48ul
2、将总的混合液装到一定数量的反应管中，每管48ul。

3、在每个反应管中加入2ul相应的cDNA第一链的产物。

4、如果没有热盖的热循环仪时，则在每个反应管中加入30ul的矿物油覆盖反应液。

5、使用以下的通用循环程序。

起始模板的解链94℃2min
循环:30轮
变性94℃30s
退火55℃30s
延伸72℃1min
最终的延伸72℃5min
保存4℃直到用
七、心得体会
通过本次课程设计，我感触颇多但是由于篇幅有限，在此就从简概括了。

首先，我深深得体会到，我们本科阶段所学的知识相当的有限而且只是理论，用本科所学不能解决实际的实验问题。

其次，从真核生物特别是人的组织中提取RNA是相当得复杂和麻烦的。

而且有相当多的干扰因素如RNA酶等。

所以提取真核生物组织中的RNA时必须严格遵守实验教程。

最后，本次设计我通过查阅大量的资料，学到了相当多的知识，这些知识是在本科的教材上无法学到的。

所以这样的课程设计是很有意义的，应该继续开展下去。

八、参考文献
1［美］R.E.法雷尔.RNA分离与鉴定实验指南—RNA研究方法. 北京：化学工业出版社, 2008
2屈伸,刘志国. 分子生物学实验技术. 北京：化学工业出版社, 2008
3 吴乃虎. 基因工程原理. 北京:：科学出版社, 2010
4 贺淹才. 基因工程概论. 北京：清华大学出版社, 2010
5 孙明. 基因工程. 北京: 高等教育出版社，2006。