乳铁蛋白的分离与纯化

亲合色谱法
不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，
基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一
定长度的可以连接基质的有机物 例如，肝素琼脂糖亲合色谱 能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且 经电泳分析表明其纯度极高。
例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚
亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈 蓝色, 装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直 接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0-2.8 浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度 0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来 说,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和 免疫球蛋白,并且产品的纯度极高。
色谱法 ----吸附色谱法
是利用的。疏 水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分 离上有重要的应用。一般以Toyopearl 为基质,在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平 衡后再装柱,用去离子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脱,得纯度为 80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比 较小,效率比较低.
于蕾
乳铁蛋白的价值
乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道
细胞对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒， 抗氧化，抗癌，调节机体免疫反应等多种功 能，并己广泛应用于食品，畜牧等行业。 LF 可耐受较高温 度,使之在 饲料加工过程 中不易变性失活，它促进铁的转运和吸收, 可以治疗仔猪贫血。它具有广谱的抗菌，抗 病毒作用,可用来预 防和 治疗仔 猪 腹泻:它 具有调节免疫系统活性的作用，增强家畜对 疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂质氧化 作用,可用作防霉剂和抗 氧化剂。
超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是
根据膜孔径不同可以实现不同分子质 量和分子形状的大分子物质的分离， 非常适合热敏性的功能性组分的分离。 选用孔径或截留分子量不同的一系列 超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产 Lf基料。
盐析法 和层析法
从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用
电泳和分光光度法检测其纯度和含量 所获得的乳铁蛋白的分子质量为 90000u,纯度大约为92%。采用3次盐析 和1次凝胶层析的方法。
凝胶层析：
为了获得较高纯度的LF，选用
sephadex-G-100 对LF进行分离和纯化。
将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶
层析柱，在20℃条件下以0.2mL/min的 流速 进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的 PBs（Nacl含量 8g/1000mL)，待出现 峰值后收集洗脱液，每管收集lmL。
盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小
的蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀 30min后，4℃条件4000r/min离40min; 将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉 30min后,4℃条件下4000r/min离心40min， 除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用 85%的饱和硫酸铵沉淀30min。 此时需在PH8.5的情况下，4℃4000r/min, 离心40min。 此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。
LF 的鉴 定
采用非连续性SDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析
分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产 物进行检测。 采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋 白的浓度进行测定。
结果与分析
由于LF的pH为7.0-8.0,所以本
试验凝胶层析选用的洗脱液为 pH7.4的PBS，在这个pH范围内 均可以得到LF。由图1可知峰l 显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但
图4显示A475值未能达到一般分光光度法 的线性范围(0.1-0.7)。这是由于A475 与LF铁饱和度有关100%铁饱和度的LF 的A475仅为0.57。LF的铁饱和度越 低,A4A475就越低本文制备的LFA475 为0.116,则质 量浓度为 101.73g/ml.
鉴于分光光度法快速，简便,对仪器设备的要 求不高。 虽然准确性不是很高，但可以快速地测定LF 的量适用于工厂中分离纯化过程中的在线检 测。通过以上结果可见,采用3次盐析和1次 凝胶层析提取LF的效果好于2 次盐析和2次 凝胶层析，本次试验所获得的LF的含量 较 高，能够减少再次凝胶层析过程中LF的损失， 并且 所获得的LF的纯度也较高，可应用于 医药行业
分光光度法
采用分光光度法测 定LF浓度,首先利 用纯度为92%的LF 溶液在400-650nm 下扫描，发现在475nm波长产生特征吸 收峰(见图3)于475nm测定其吸光度,作 出浓度C与吸光度A之间关系的线性回 归方程,如图四,得方程 为:c=827.49A+5.7315(R2=0.9954)。
试验方 法
乳样前期处理： 乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去 脂 肪和大量的酪蛋白, 物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离 心脱去脂肪(4℃，3000r/min、30min)得到脱脂乳， 将脱脂乳稀释后， 边搅拌边向其中加入 1mol/L 盐 酸溶液调整脱脂乳的 pH 值到 4.6(酪蛋白的等电点)， 室温放置 30min，离心除去酪蛋白(4℃、 10000r/min、30min)，得到的上清就是我们需要的乳 清，用它来分离 Lf
乳铁蛋白LF ,是存在于哺乳动物外分泌液中
的一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋 白相 似，但铁结合能力是转铁蛋白的 260 倍， LF是由689个氨基酸组成的单一多链分子。 每个分子中有2个金属结合位点，每个位点 可结合一个Fe3+和一个HCO3-或CO3。Lf 的铁 结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高 浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而 在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合 能力则减弱。
是非LF成分含量却很低,可以忽略,样品纯度比较高 经SDS-PAGE电泳检测仅出现一条可见的区带,相对 分子质量为9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分 析LF的纯度达 到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收 峰峰值较大,说明LF含量较高,但是样品不纯,含有 其他成分,经SDS-PAGE电泳检测结果为峰2样品中含 有两种成分,峰3样品中含有三种成分。峰IV则说明 样品的各个成分含量都很低,经SDS-PAGE 电泳检测 可见条带非常不清晰.
固定化单克隆抗体法
利用抗原-抗体之间的高特异性结合
在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进
行免疫,经一系列操作分离出抗体,用抗体和 异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色 谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液, 用洗脱 0.2 mol/L pH2.7醋酸缓冲液(含0.1 5mol/L NaCl)洗脱。 ----成本贵
离子吸附法
1 最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯
化得到较纯的Lf. 2 磷酸纤维素交换色谱法 羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于Lf和乳 过氧化氢酶的分离纯化, 用pH值7.7,浓度0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓 度0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱,它可 将Lf的a,b两种变异体分离出来,而且树脂能用 浓度0.2mol/L的NaOH溶液和浓度0.2mol/L的 HCI溶液再生,此法相对来说要更有效
自 1960年以来人们就试着采用各种方
法来制备LF如 离子交换层析色谱,超滤,固定化单克隆 抗体,亲和层析等从人乳或牛乳中分离 纯化 LF，但色谱法和固定化单克隆抗 体法虽能获得较高纯度的 LF但价格昂 贵技术要求高,所以并不适用于工业化 生产. 超滤法简便费用低,易形成 工业化生产， 但 LF 纯度低膜需要经常清洗。