乳铁蛋白的分离与纯化
乳铁蛋白的分离工艺研究
乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。
科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。
包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。
这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。
乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。
LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70～80kD，LF上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺、藻糖等。
LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。
在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml，比常乳高近50倍。
我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。
但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。
初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。
因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。
本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。
1 原料与器材1.1 原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3ｄ内收集的样品，CM-Sephadex C-50：进口分装BMK（Shanghai）Sci & Tech Ltd，CM-SEPHAROSE FAST FLOW，LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS（十二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝R-250等。
乳铁蛋白的分离工艺
2023-11-07
contents
目录
• 乳铁蛋白简介 • 分离工艺流程 • 分离工艺核心技术 • 分离工艺优化 • 分离工艺应用实例
01
乳铁蛋白简介
乳铁蛋白的定义
乳铁蛋白是一种多功能的蛋白质，具有多种生物 学活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物等。
乳铁蛋白在乳汁中含量较高，尤其是初乳中，是 婴儿重要的营养来源之一。
05
分离工艺应用实例
从牛乳中分离乳铁蛋白
提取
将牛乳中的乳铁蛋白提取出来，常 用的方法包括盐析、有机溶剂沉淀 等。
分离
利用乳铁蛋白与其他蛋白质的性质 差异，如电泳、色谱等，将其与其 他蛋白质分离。
纯化
进一步去除杂质，提高乳铁蛋白的 纯度。
干燥
将乳铁蛋白从溶液中干燥，得到干 燥的乳铁蛋白产品。
从酵母中表达乳铁蛋白
乳铁蛋白的应用领域
乳铁蛋白被广泛应用于营养补 充剂、功能性食品、药品等领 域。
在营养补充剂方面，乳铁蛋白 被用于补充婴幼儿、老年人等 人群的营养需求。
在功能性食品方面，乳铁蛋白 被用于开发具有抗氧化、抗炎 等作用的功能性食品。
在药品方面，乳铁蛋白被用于 预防和治疗一些疾病，如贫血 、炎症等。
02
感谢您的观看
THANKS
反Байду номын сангаас色谱
原理
利用乳铁蛋白的极性表面进行分离。
应用
常用于分离和纯化具有极性的蛋白质，如乳铁 蛋白。
优化
选择合适的反相色谱介质和洗脱条件，可提高乳铁蛋白的纯度和回收率。
分子筛色谱
原理
01
利用乳铁蛋白的分子大小进行分离。
应用
02
常用于进一步纯化乳铁蛋白，能去除与乳铁蛋白分子大小差异
乳铁蛋白的分离与纯化
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亲合色谱法
不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，
基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一定长 度的可以连接基质的有机物
例如，肝素琼脂糖亲合色谱
能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且经 电泳分析表明其纯度极高。
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例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚亚氨 二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈蓝色,
第十二页，共18页。
盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小的 蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀 30min后，
4℃条件4000r/min离40min; 将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉
30min后,4℃条件下4000r/min离心40min，除
去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用
85%的饱和硫酸铵沉淀30min。 此时需在PH8.5的情况下，4℃4000r/min,离
心40min。
此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。
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凝胶层析：
为了获得较高纯度的LF，选用 sephadex-G-100 对LF进行分离和纯化。 将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶层
析柱，在20℃条件下以0.2mL/min的流 速 进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的PBs （Nacl含量 8g/1000mL)，待出现峰值后
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超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是根 据膜孔径不同可以实现不同分子质量和 分子形状的大分子物质的分离，非常适 合热敏性的功能性组分的分离。选用孔 径或截留分子量不同的一系列超滤膜， 可以以干酪乳清为原料生产 Lf基料。
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盐析法 和层析法
乳铁蛋白水解物修饰物的分离纯化及其抗大肠杆菌活性
乳铁蛋白水解物修饰物的分离纯化及其抗大肠杆菌活性马春敏;薄力影;范婧;李铁晶【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)001【摘要】利用胃蛋白酶水解乳铁蛋白得到最小抑菌浓度为200 mg/mL的乳铁蛋白水解物(LHS),进行类蛋白反应导入色氨酸(Trp)得到乳铁蛋白水解物修饰物.对LHS及其色氨酸修饰产物采用葡聚糖凝胶过滤色谱G-25进行分离纯化,收集出峰产物,比较各级产物的抗大肠杆菌活性.结果表明,LHS和Trp修饰物分离纯化后的峰1为抑菌活性峰,各级产物的抑菌效果为LHS＜ LHS纯化峰1产物＜Trp修饰产物＜Trp修饰产物纯化峰1产物.加样浓度200 mg/mL时,LHS、Trp修饰物对大肠杆菌的抑菌率分别为40.42％和85.83％.加样浓度100 mg/mL时,LHS纯化峰1产物、Trp修饰物、Trp修饰物纯化峰l产物对大肠杆菌抑菌率分别为41.12％、58.31％和88.00％.可见,色氨酸修饰物对大肠杆菌的抑菌率较未修饰前提高了45.41％,色氨酸修饰产物经过纯化后对大肠杆菌的抑菌率较未纯化前提高了29.69％.将收集的活性峰作为样品,采用反相高效液相色谱进一步分离鉴定,证明经过分离纯化得到了纯度相对较高且活性提高的抗菌肽.【总页数】5页(P92-95,106)【作者】马春敏;薄力影;范婧;李铁晶【作者单位】辽宁大学,辽宁大学轻型产业学院,辽宁沈阳110000;乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;辽宁大学,辽宁大学轻型产业学院,辽宁沈阳110000;乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.酪蛋白磷酸肽、木糖醇等成分对乳铁蛋白抗大肠杆菌活性影响 [J], 胡志和;庞广昌;陈庆森;阎亚丽2.牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化及其抗菌活性研究 [J], 邬向东;李平华;陈如圣;全炳昭;罗军荣3.菜籽蛋白水解物的分离纯化及抗肿瘤活性研究 [J], 姚轶俊;袁强;鞠兴荣;王立峰4.牛乳铁蛋白活性多肽LfcinB在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析 [J], 刘珂杭;宗西翠;张慧丹;完颜杨珂;陈玉清5.猪血清免疫球蛋白IgG的分离纯化及抗大肠杆菌作用 [J], 孟腾飞;韩愈杰;王敬;魏萌;吴国江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乳铁蛋白综述
摘要乳铁蛋白是转铁蛋白家族的一员，一种可以结合铁的糖蛋白，分子量在80kDa左右，是近期研究较热门的蛋白之一。
乳铁蛋白分子由一条肽链进行了折叠后形成两个对称的叶（N叶和C叶），两叶上都有铁结合位点。
缺铁的乳铁蛋白和铁饱和的乳铁蛋白之间的构型有变化，可以相互转换。
乳中的乳铁蛋白在脱脂和去酪蛋白后，可以用色谱、超滤、盐析等方法分离纯化，电泳法、HPLC、ELISA 等方法可以用来检测乳铁蛋白的含量。
关键词：乳铁蛋白铁结合折叠纯化检测AbstractLactoferrin is an80kDa iron-binding glycoprotein of the transferrin protein family.It is a simple polypeptide chain folded into two symmetrical lobes(N and C lobes)。
Each lobe can bind a iron atom.The conformations of LF vary depending on whether it is binding Fe3+.LF from the milk can be separated and purified by chromatography,ultrafiltration or salting after degreasing and remove the casein.The concentration of LF can be measured by electrophoresis,HPLC,ELISA and so on.Key Words:lactoferrin iron-binding fold purification measurement乳铁蛋白（Lactoferrin ，LF ）是近期研究比较热门的蛋白，具有转运铁的功能，能够促进人体铁的蛋白。
乳铁蛋白高纯度作用
乳铁蛋白高纯度作用乳铁蛋白是一种重要的蛋白质，在生物体内起着多种重要的作用。
乳铁蛋白的高纯度对于它的作用具有重要的影响。
本文将详细介绍乳铁蛋白的高纯度及其作用。
乳铁蛋白是一种由乳腺分泌的球状蛋白质，含有丰富的铁元素。
它在乳汁中占据重要地位，对于婴儿的生长发育起着至关重要的作用。
乳铁蛋白的高纯度意味着它的纯度非常高，不含杂质，具有更好的生物活性和生物利用度。
乳铁蛋白高纯度的主要好处之一是它具有较高的铁载体能力。
铁元素在人体内起着重要的作用，参与血红蛋白的合成以及氧气的运输。
乳铁蛋白高纯度含有更多的铁元素，可以更有效地帮助人体补充铁元素，预防贫血等相关疾病。
乳铁蛋白高纯度还具有较好的抗菌作用。
乳铁蛋白能够与细菌结合，形成复合物，从而抑制细菌的生长和繁殖。
乳铁蛋白高纯度的抗菌作用更为显著，可以有效地抑制多种细菌的生长，对于预防和治疗感染性疾病具有重要意义。
乳铁蛋白高纯度还具有较好的抗氧化性能。
抗氧化作用是指乳铁蛋白能够清除自由基，减少氧化反应的发生，保护细胞免受氧化损伤。
乳铁蛋白高纯度中含有更多的抗氧化物质，可以更有效地对抗氧化应激，保护细胞免受氧化损伤。
乳铁蛋白高纯度还具有其他多种生物活性。
研究表明，乳铁蛋白高纯度可以调节免疫系统功能，增强机体的免疫力。
它还具有促进肠道健康、促进骨骼生长发育等作用。
乳铁蛋白高纯度的制备方法主要有超滤法、离子交换法等。
超滤法是利用超滤膜对乳铁蛋白进行分离纯化，得到高纯度的乳铁蛋白。
离子交换法是利用离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附和洗脱，得到高纯度的乳铁蛋白。
乳铁蛋白高纯度的应用非常广泛。
在食品工业中，乳铁蛋白高纯度可以用作食品添加剂，增加食品的营养价值。
在医药领域，乳铁蛋白高纯度可以用于制备铁元素补充剂，治疗贫血等相关疾病。
此外，乳铁蛋白高纯度还可以用于制备化妆品、保健品等。
乳铁蛋白高纯度具有多种重要的作用。
它不仅具有较好的铁载体能力，还具有抗菌、抗氧化等多种生物活性。
乳铁蛋白
食品工业
截至2021年，市场上含有乳铁蛋白的产品丰富多样，包括酸奶、脱脂乳、保健食品和发酵乳制品等众多产品。 在 20世纪末期，日本的乳制品公司就开始生产并销售含乳铁蛋白的婴幼儿配方奶粉，乳铁蛋白添加到婴幼儿奶 粉中的益处很多，包括促进对铁的吸收、改善肠道菌群等作用。
检测方法
截至2021年，报道的乳铁蛋白的检测方法包括酶联免疫法、高效毛细管电泳法、生物传感测定法、高效液相 色谱法、高效液相-质谱联用法等 。
分离方法
传统方法
纯化乳铁蛋白的方法有许多种，许多公司选择阳离子交换色谱系统来大范围的获得乳铁蛋白。对于乳铁蛋白 的分离纯化开始于上世纪80年代，许多公司都致力于开发获得高纯度乳铁蛋白工艺。对乳铁蛋白分离纯化的方法 从最初的阳离子交换到亲和层析再到免疫学方法，以及各种方法的组合对于分离纯化乳铁蛋白都有个有利弊 。
简介
来源
乳铁蛋白（Lactoferrin）是由科学家Johanson Bengt于1960年在母乳中发现的 。随后Baggin等科学家在 一些生物体的体液和各种细胞中发现了这种蛋白质并开始了大量研究。研究表明，乳铁蛋白LF是动物初乳中的天 然蛋白质，是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡;调节骨髓细胞的生成， 促进细胞的生长;调节机体免疫功能，增强机体抗病能力;抑制人体肿瘤细胞的作用;能同多种抗生素及抗真菌制 剂协同作用，更有效地治疗疾病。
乳铁蛋白肽的制备
Tomita和Bellamy等根据乳铁蛋白水解生成乳铁蛋白肽的条件，提出制备乳铁蛋白的方法。主要步骤是利用乳铁蛋白为原料，加入盐酸。胃蛋白酶水解，离心，然后经TSK-GEI120柱分离，再经COS-MOSILSCN-R柱纯化，冷冻干燥。利用这种方法制备的乳铁蛋白肽纯度在95&以上，但仅适用于实验室小量制备。
近日，旅德学者，中国科学院亚然带农业生态研究所兼职研究员张友明博士主持的一项中国科学院海外杰出青年基金项目-——“基因工厂生产富Lactoferricin B的功能饲料及食品”取得重要进展，成功获得了可高达Lfcin B和E.Coli基因工程菌。这项工作成果可能会大幅度降低牛乳铁蛋白肽的生产成本，使其作为添加剂应用于饲料工业和养殖业成为可能，并为我国创新具有自有知识产权的新药提供了可能。
乳铁蛋白和Lfcin独特的生理功能和特性引起了广大研究者的重视，乳铁蛋白，Lfcin及其转基因研究成了国内外研究热点，已有许多学者克隆了人，牛和猪乳铁蛋白基因，并在细菌，真菌，植物和动物细胞中成功表达，且正在研究表达产物在医学和动物营养中的应用效果，但研究焦点集中在人和牛乳铁蛋白及其Lfcin。目前，Nakamura等，用昆虫细胞表达了LFcinB N端部分，国内华南农业大学的温刘发在进行毕赤酵母表达Lf-cinB基因的研究，而张锦霞等通过DNA转染的方法实现了LFcinB在山羊与与奶牛乳腺组织中的表达。最近，吕芙蓉在大肠杆菌中融合表达了天然型和突变型LfcinB,并初步测定了表达产物的抗菌活性，为进一步研究LfcinB结构和功能的关系蓦定了基础。
3.4.2.转基因制备
目前，给动物滥用抗生素威胁着人类自身健康和动物的持续健康生产，因此，科学工作者必须寻找安全的新型抗生素替代物解决该问题。牛初乳蛋白肽由牛乳铁蛋白经蛋白酶降解产生，具有多种生理功能，且不易产生抗生性，是一种有着广阔应用前景的新型抗菌肽。然而天然分离Lfcin B产量低，工艺复杂，成本昂贵，人工合成 Lfcin B及其衍生物费用更高，无法大规模生产，成为Lfcin B广泛应用的重要制约因素。随着现代生物技术的发展，利用转基因方法将作为蛋白肽类的乳铁蛋白肽转入其他生物中表达，是解决工业用Lfcin B来源不足最具潜力的途径。
《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》
《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》一、引言牛初乳因其含有丰富的营养成分，尤其是乳铁蛋白等生物活性物质，具有极高的营养价值和医疗保健作用，近年来备受关注。
乳铁蛋白作为一种重要的生物活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化的作用，对于提高人体免疫力、促进生长发育等方面具有重要作用。
因此，对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究具有重要的实际意义和应用价值。
二、材料与方法2.1 材料牛初乳、盐、乙醇、硫酸铵等化学试剂。
2.2 方法（1）牛初乳的收集与预处理选择健康的母牛，在分娩后3天内收集初乳。
经过初步的过滤和消毒处理后，进行后续的乳铁蛋白提取实验。
（2）乳铁蛋白的提取采用不同的提取方法，如盐析法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法等，对牛初乳中的乳铁蛋白进行提取。
通过比较各种方法的提取效果，选择最佳的提取方法。
（3）乳铁蛋白的分离纯化采用透析、超滤、凝胶过滤等方法对提取得到的乳铁蛋白进行分离纯化。
通过SDS-PAGE电泳、紫外可见光谱等方法检测纯化效果，确定最佳的分离纯化工艺。
三、结果与分析3.1 乳铁蛋白的提取结果通过比较不同提取方法的效果，发现硫酸铵沉淀法在牛初乳中乳铁蛋白的提取效果最佳。
在一定的硫酸铵浓度和温度条件下，可以有效地将乳铁蛋白从牛初乳中沉淀出来。
3.2 乳铁蛋白的分离纯化结果通过透析、超滤、凝胶过滤等方法的组合应用，可以有效地将乳铁蛋白从其他杂质中分离出来，并达到较高的纯度。
SDS-PAGE电泳和紫外可见光谱检测结果表明，经过分离纯化后的乳铁蛋白具有较高的纯度，且分子量与标准品一致。
3.3 工艺参数优化通过对工艺参数的优化，如硫酸铵浓度、沉淀时间、透析时间等，可以进一步提高乳铁蛋白的提取率和纯度。
同时，通过对不同批次牛初乳的试验，验证了该工艺的稳定性和可靠性。
四、讨论本研究通过对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究，发现硫酸铵沉淀法结合透析、超滤、凝胶过滤等方法可以有效地提取和纯化牛初乳中的乳铁蛋白。
强阳离子交换色谱法从牛初乳中 分离纯化乳铁蛋白的研究
强阳离子交换色谱法从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的研究卢蓉蓉1,2，许时婴2，王 璋2，杨瑞金1,2(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)摘 要：本实验研究了离子交换色谱技术大规模纯化乳铁蛋白的色谱条件。
选用的SP Sepharose Fast Flow离子交换剂对乳铁蛋白有很好的吸附选择性，洗脱速度可达到2L/h。
以pH值为7.7～8.0，10mmol/L的磷酸盐为起始缓冲液，通过改变离子强度进行分步洗脱。
先采用0.5mol/L的NaCl溶液选择性洗脱分泌型免疫球蛋白A和乳过氧化物酶组分，再采用1mol/L的NaCl洗脱LF组分。
经SDS-PAGE测定，所得乳铁蛋白组分显示为单一区带，相对分子质量为80400Da。
经等点聚焦测定，所得乳铁蛋白的等电点为8.65。
中试生产的精制品中乳铁蛋白的纯度和回收率分别为94.20%和75.45%。
关键词：乳铁蛋白；分离纯化；强阳离子交换色谱；中试规模Purification of Lactoferrin from Bovine Colostrum with Strong Cation ExchangeChromatography on Pilot ScaleLU Rong-rong1,2，XU Shi-ying2，WANG Zhang2，YANG Rui-jin1,2(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2.School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)Abstract ：A stepwise procedure for purification of lactoferrin (LF) extracted from bovine colostrum by ion exchange chromatography on a pilot scale was investigated. SP Sepharose Fast Flow (SP Sepharose FF) of excellent absorption speciality for LF, was chosen as the ion exchanger with elution rate of 2 L/h. 0.5 mol/L NaCl aqueous solution was used to elute the secretory immunoglobulin A and lactoperoxidase. Then, lactoferrin was eluted with 1.0 mol/L NaCl aqueous buffer. Lactoferrin fraction is shown as a single band in SDS-PAGE with molecular weight of 80400 Da. The isoelectric point of lactoferrin is 8.65 determined by isoelectric focusing. The purity of refined LF on pilot production is 94.20% with a yield of 75.45%.Key words：lactoferrin；purification；strong cation exchange chromatography；pilot scale中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)07-0048-06应用色谱技术从牛初乳中分离乳铁蛋白(lactoferrin，以下简称L F)的方法很多。
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亲合色谱法
不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，
基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一
定长度的可以连接基质的有机物 例如，肝素琼脂糖亲合色谱 能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且 经电泳分析表明其纯度极高。
例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚
亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu2+交换后该树脂呈 蓝色, 装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直 接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0-2.8 浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度 0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来 说,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和 免疫球蛋白,并且产品的纯度极高。
色谱法 ----吸附色谱法
是利用的。疏 水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分 离上有重要的应用。一般以Toyopearl 为基质,在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平 衡后再装柱,用去离子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脱,得纯度为 80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比 较小,效率比较低.
于蕾
乳铁蛋白的价值
乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道
细胞对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒， 抗氧化，抗癌，调节机体免疫反应等多种功 能，并己广泛应用于食品，畜牧等行业。 LF 可耐受较高温 度,使之在 饲料加工过程 中不易变性失活，它促进铁的转运和吸收, 可以治疗仔猪贫血。它具有广谱的抗菌，抗 病毒作用,可用来预 防和 治疗仔 猪 腹泻:它 具有调节免疫系统活性的作用，增强家畜对 疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂质氧化 作用,可用作防霉剂和抗 氧化剂。
超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是
根据膜孔径不同可以实现不同分子质 量和分子形状的大分子物质的分离， 非常适合热敏性的功能性组分的分离。 选用孔径或截留分子量不同的一系列 超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产 Lf基料。
盐析法 和层析法
从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用
电泳和分光光度法检测其纯度和含量 所获得的乳铁蛋白的分子质量为 90000u,纯度大约为92%。采用3次盐析 和1次凝胶层析的方法。
凝胶层析：
为了获得较高纯度的LF，选用
sephadex-G-100 对LF进行分离和纯化。
将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶
层析柱，在20℃条件下以0.2mL/min的 流速 进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的 PBs（Nacl含量 8g/1000mL)，待出现 峰值后收集洗脱液，每管收集lmL。
盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小
的蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀 30min后，4℃条件4000r/min离40min; 将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉 30min后,4℃条件下4000r/min离心40min， 除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用 85%的饱和硫酸铵沉淀30min。 此时需在PH8.5的情况下，4℃4000r/min, 离心40min。 此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。
LF 的鉴 定
采用非连续性SDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析
分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产 物进行检测。 采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋 白的浓度进行测定。
结果与分析
由于LF的pH为7.0-8.0,所以本
试验凝胶层析选用的洗脱液为 pH7.4的PBS，在这个pH范围内 均可以得到LF。由图1可知峰l 显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但
图4显示A475值未能达到一般分光光度法 的线性范围(0.1-0.7)。这是由于A475 与LF铁饱和度有关100%铁饱和度的LF 的A475仅为0.57。LF的铁饱和度越 低,A4A475就越低本文制备的LFA475 为0.116,则质 量浓度为 101.73g/ml.
鉴于分光光度法快速，简便,对仪器设备的要 求不高。 虽然准确性不是很高，但可以快速地测定LF 的量适用于工厂中分离纯化过程中的在线检 测。通过以上结果可见,采用3次盐析和1次 凝胶层析提取LF的效果好于2 次盐析和2次 凝胶层析，本次试验所获得的LF的含量 较 高，能够减少再次凝胶层析过程中LF的损失， 并且 所获得的LF的纯度也较高，可应用于 医药行业
分光光度法
采用分光光度法测 定LF浓度,首先利 用纯度为92%的LF 溶液在400-650nm 下扫描，发现在475nm波长产生特征吸 收峰(见图3)于475nm测定其吸光度,作 出浓度C与吸光度A之间关系的线性回 归方程,如图四,得方程 为:c=827.49A+5.7315(R2=0.9954)。
试验方 法
乳样前期处理： 乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去 脂 肪和大量的酪蛋白, 物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离 心脱去脂肪(4℃，3000r/min、30min)得到脱脂乳， 将脱脂乳稀释后， 边搅拌边向其中加入 1mol/L 盐 酸溶液调整脱脂乳的 pH 值到 4.6(酪蛋白的等电点)， 室温放置 30min，离心除去酪蛋白(4℃、 10000r/min、30min)，得到的上清就是我们需要的乳 清，用它来分离 Lf
乳铁蛋白LF ,是存在于哺乳动物外分泌液中
的一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋 白相 似，但铁结合能力是转铁蛋白的 260 倍， LF是由689个氨基酸组成的单一多链分子。 每个分子中有2个金属结合位点，每个位点 可结合一个Fe3+和一个HCO3-或CO3。Lf 的铁 结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高 浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而 在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合 能力则减弱。
是非LF成分含量却很低,可以忽略,样品纯度比较高 经SDS-PAGE电泳检测仅出现一条可见的区带,相对 分子质量为9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分 析LF的纯度达 到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收 峰峰值较大,说明LF含量较高,但是样品不纯,含有 其他成分,经SDS-PAGE电泳检测结果为峰2样品中含 有两种成分,峰3样品中含有三种成分。峰IV则说明 样品的各个成分含量都很低,经SDS-PAGE 电泳检测 可见条带非常不清晰.
固定化单克隆抗体法
利用抗原-抗体之间的高特异性结合
在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进
行免疫,经一系列操作分离出抗体,用抗体和 异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色 谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液, 用洗脱 0.2 mol/L pH2.7醋酸缓冲液(含0.1 5mol/L NaCl)洗脱。 ----成本贵
离子吸附法
1 最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯
化得到较纯的Lf. 2 磷酸纤维素交换色谱法 羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于Lf和乳 过氧化氢酶的分离纯化, 用pH值7.7,浓度0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓 度0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱,它可 将Lf的a,b两种变异体分离出来,而且树脂能用 浓度0.2mol/L的NaOH溶液和浓度0.2mol/L的 HCI溶液再生,此法相对来说要更有效
自 1960年以来人们就试着采用各种方
法来制备LF如 离子交换层析色谱,超滤,固定化单克隆 抗体,亲和层析等从人乳或牛乳中分离 纯化 LF，但色谱法和固定化单克隆抗 体法虽能获得较高纯度的 LF但价格昂 贵技术要求高,所以并不适用于工业化 生产. 超滤法简便费用低,易形成 工业化生产， 但 LF 纯度低膜需要经常清洗。