分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理

（一）利用分子大小

1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。

方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行

涉及的问题：

如何加快透析过程

（1）加大浓度差，及时更换透析液

（2）利用磁力搅拌器

常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成

2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上

3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。

结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来

（二）利用溶解度差别

4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。

5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析

（三）根据电荷不同

6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。

氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：

碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。

因此洗脱顺序应该是：

酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸

为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法