环境生物学实验指导-11环科

环境生物学实验指导专业：环境科学时间：二零零九年九月环境生物学实验指导一、课程简介环境生物学是环境科学专业开设的一门重要的专业必修课。

通过本课程的学习，了解生物与环境之间的相互作用及其关系，生物在环境监测、环境评价、环境修复中的作用以及环境污染物的生物降解与转化规律，生物技术在环境治理中的应用等有关基本知识。

系统地掌握环境生物学的基本理论、基本知识和基本技能。

二、课程实验目的和要求：1 、目的：通过实践操作，印证和巩固课堂教学中学到的环境生物学的理论知识，学会实地观察的技术，培养进行科学工作的能力，养成实事求是的工作作风和解决实际问题的能力。

2 、要求：要求学生能够正确使用实验室的基本仪器设备，掌握环境生物学实验的基本操作技术，并能够客观地对实验进行观察、描述、比较、分析和综合。

三、考试（考核）方式：以考核方式进行，要求学生独立完成每个实验并提交报告，并用百分制记分，然后求平均分 = 总分 / 实验次数。

其实验成绩占课程总评成绩的 30% 。

实验内容在课程考试中占 30% 。

四：主要仪器：光学显微镜（含有关配件）50 台，超净工作台4台，高压蒸气灭菌锅2只，烘箱、恒温培养箱各3台，电炉 10 只，酒精灯、载玻片、接种环（针）、培养皿、试管、移液管、锥形瓶等若干。

五、主要参考书目：[1] 孔繁翔，环境生物学，南京：南京大学出版社。

[2] 王家玲，环境微生物学实验，北京：高等教育出版社。

[3] 程树培，环境生物技术实验指南，南京：南京大学出版社。

实验一有毒物质对水生生物的影响或急性毒性实验（4学时）农药是一类特殊化学品。

农药引起的环境污染和对生物的影响日益突出。

在施用过程中,仅有1 %左右的农药作用于靶生物，其余的或残留于土壤,或通过间接途径进入水环境，从而影响土壤生物和水生生物。

水环境中的农药可通过食物链途径逐级浓缩，从而导致对水生态系统的危害，甚至可最终危害人类健康。

农药对水生生物的毒性是农药的生态风险评价和管理的重要参数。

一、实验目的和内容百草枯、草甘膦、敌杀死和乐果是目前我国广泛施用的除草剂和高效杀虫剂。

本实验采用急性毒性实验来研究农药对水生生物的影响。

二、实验材料实验动物：体长约5~8cm的鲫鱼；实验药品：草甘膦实验仪器：塑料桶（容量约﹥10L）；容量瓶（100ml）；移液管；烧杯（250ml）；三、实验方法步骤(一)急性毒性试验的一般程序1．急性试验剂量分组(1)先查阅文献，找出与受试化学物结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其相同生物种类和相同染毒途径得出LD50(LC50)值作为受试物的预期毒性中值。

(2)以此LD50(LC50)为待测化合物的中间剂量组，再上下以3倍之差的剂量各推1～2个剂量组做预试验，求出生物全活、全死剂量。

(3)在预试验的全活全死剂量之间设5～6个剂量组，一般的各组间距按1.2～1.5等比级数设计。

2．选用适宜的染毒方式染毒，观察两周内的死亡情况。

3．症状观察：LD50值并不能充分说明受试化合物的急性毒性，因此应详细观察实验动物接触不同剂量外源化合物后的中毒症状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点、死亡时间等。

一般常见的中毒症状有兴奋现象、抑制现象。

4．剖检死亡和濒死动物及部分存活动物，做大体病理解剖检查。

5．计算LD50(LC50)，及其标准法。

通常采用寇氏法和几率单位法。

6．根据所得结果，按相关急性毒性分级标准，评定其毒性大小，如急性毒性作用带愈小，则引起死亡的危险性就愈大，反之，则愈小；LD50值愈小，毒性愈大。

(二)本实验方法步骤1、农药的配制：母液稀释法（二次稀释法）即先用少量的水把农药稀释，配成母液，再用大量的水把母液稀释成所需浓度。

这样配出的药液高效又稳定！2、剂量分组按水生生物急性毒性试验标准方法进行。

每种农药设6～7 个试验浓度组,并同时设一对照组。

每组5-6条鱼。

3、实验条件实验用鱼体长约5-8cm，选择行动活泼、体色光泽完整的健康鱼；实验容器采用塑料桶，盛水量以每尾鱼1-2L水为宜，水的pH值为6.7-8.5，水温为室温；水中的溶解氧不应低于4mg/L，用放置3天以上的自来水；试验期间的光暗比为12∶12，温度23 ±1 ℃。

4、LD50计算方法：直线内插法四、实验报告1、实验目的2、实验方法步骤3、实验结果（观察结果并计算LD50）并分析试验结果实验二不同类型水体中细菌总数的检测及水质量评价（4学时）水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。

因此，它是评价水质污染程度的重要指标之一。

本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。

由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状、成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或其一环境条件能满足—个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。

细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，37℃24h培养后所生长的菌落数。

一般规定，1mL自来水的总菌数不得超过100个。

水污染的细菌学指标：①饮用水卫生标准细菌总数<100个/mL 大肠菌群<3个/L一、目的和内容了解并掌握水中细菌总数的测定方法。

二、材料和器皿(—)固体培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）牛肉膏3g；蛋白胨5g；氯化钠10g；琼脂15～20g； pH 7.0～7.2；水1000ml硫代硫酸钠(二)无菌采样瓶，灭菌移液管，灭菌培养皿，盛有4.5mL灭菌蒸馏水的试管，高压灭菌锅，废旧报纸，放大镜。

三、方法和步骤(一)采集水样：注意采集水样的代表性和数量，详见第四章。

水样采集与保存：要求按无菌操作进行采样，全过程不受污染①采样自来水：先用酒精灯将龙头灭菌→水龙头完全打开放水数分钟(排除管道内积存的死水)→采集水样(如水样中含有余氯，要采取相应措施消除氯，即3%硫代硫酸钠1ml/500ml)江、河、湖、塘、水库等处水：→先将采样瓶灭菌→将采水器在距水面10～15cm深处取样。

采样后，采样瓶内的水面与瓶塞底部应留有一些空隙，以便在检验时可充分摇动，混匀水样。

②保存立即检验：一般从取样到检验不应超过2h保证原水中细菌不起变化。

不能立即检验：可在1～5℃下冷藏保存，不得超过6h(二)吸取0.5ml水样(河水、污水、游泳池水或港湾水等)，注入盛有4.5ml无菌水的试管中，混匀成10-1稀释液，注意在吸水样前，水样及稀释水应彻底搅动均匀。

(三)吸稀释液0.5ml按10倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4等连续的稀释度（图2－1）。

(四)根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度，中等的选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。

稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30和300之间。

(五)吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1ml。

(六)注入彻底融化，然后冷却到45℃的肉膏蛋白胨培养基（用于河水样）约15ml，立即旋摇培养皿，充分混匀。

方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。

小心勿使这个混合液体溅到培养皿的边缘。

让平皿培养基于水平位置放置至固化。

(七)接种河水样的培养皿，倒置于37℃培养24h，接种海水样、港湾水样的培养皿，应倒置后于18~20℃下培养到长出明显菌落(5天左右)。

细菌总数检测过程中的质量控制（1）检验中所用的一切用品必须是完全灭菌的。

在灭菌前应彻底洗涤干净，121℃高压蒸汽灭菌20min，或160℃干烤2h。

培养基和稀释液按规定要求进行高压蒸汽灭菌。

（2）同时各接种空白样品、同一稀释度平行样品和不同稀释度的几个平板平皿作对照。

（3）水样稀释时应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液混入其中。

（4）将水样注入皿内时，从皿侧加入，不要揭去皿盖，最后将吸管直立使水流空，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。

（5）为防止产生片状菌落，水样加入平皿后，在20min内向皿内倾入营养琼脂培养基，并立即混合均匀。

（6）皿内琼脂凝固后，不要放置长久后才翻转培养，而应于琼脂凝固后，在数分钟内将平皿翻转进行培养，这样可避免菌落蔓延生长。

图2-1 菌液逐级稀释过程示意图四、结果与分析(一)菌落计算原则平皿菌落的计算．可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。

对那些看来相似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径，便应该一一予以计数。

对链状菌落．看来似乎是由于一团细菌在琼脂培养基和水样的混合中被崩解所致，应把这样的一条链当做一个菌落来计数，不可去数链上各个单—的菌链。

若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。

若片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。

在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。

(二)计算方法l、首先选择平均菌落效在30～300者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。

2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之间，则应按两者的比值来决定。

若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的数字。

3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

5、如果全部稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表2—l)。

6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。

为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。

在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。

五、实验报告1、阐述细菌计数原则。

2、报告样品中细菌总数。

表2－1 稀释度选择及菌落报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个/ml）报告方式（个/ml）10-110-210-31 1360 164 20 －16400 16000或1.6×1042 2760 295 46 1.6 37750 38000或3.8×1043 2890 271 60 2.2 27100 27000或2.7×1044 无法计数4651 513 －513000 510000或5.1×1055 27 11 5 －270 270或2.7×1026 无法计数305 12 －30500 31000或3.1×104实验三植物种子在不同浓度重金属溶液中萌发率的变化（4学时）1 实验原理用不同浓度重金属溶液培养植物种子，研究重金属对植物种子萌发的影响，了解和掌握植物的发芽势和发芽率进行的毒性实验的具体方法及毒物对植物发芽势与发芽率的影响；通过植物种子发芽毒性试验，了解重金属对植物种子的毒性效应，监测水体污染程度以及评价水体的使用价值，为早期预报重金属对植物的毒害，为环境监测中评价重金属污染程度提供理论依据。