基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译
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基本的银染步骤:(90min)
材料:
超纯水(>18 megohm/cm全程)、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液(40%乙醇、10%乙酸)
注意事项:
1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。
2.用干净的容器,并标明银染专用。
3.当摇动时,确保容器大小可使胶在里面自由移动,染色时溶液能完全沫过胶面。
4.在拿胶或换溶液时,避免徒手摸胶或用金属物品接触,及避免对胶施加压力。
5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。
6.避免试剂交叉污染。
7.用新鲜配置的溶液。
样品含有高浓度的DTT:
如果你的样品含有高浓度的DTT (>50mM),银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。
为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品:
1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM,并在70℃加热10min.
2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM,并在70℃加热10min.
3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。
进行电泳,并按手册进行银染。
在开始之前:
用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染:
程序:下面的程序用于8*8厘米预制胶,1.0mm厚。
如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶(18*18),保证孵育时间,将所有溶液的体积加倍。
注意:如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样,你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。
所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行,以1圈/秒的速度在室温下进行。
确保每个胶有100ml的溶液。
1. 电泳后,将胶取出至合适尺寸的银染托盘内,用超纯水简单的清洗一下。
2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转,固定胶20min。
如果你用的是Tricine 胶,那么就固定1小时。
注意:如果没有足够的时间完成银染程序,胶可以在固定液中存放一夜。
长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。
3. 倒出固定液,用30%乙醇洗胶10min。
4. 倒出乙醇,加入100ml敏化液,孵育10min.
5. 倒出敏化液,100ml 30%乙醇洗胶10min.
6. 用100ml超纯水洗胶10min.
7. 用100ml 染色液孵育胶15min.
8. 染色完成后,倒掉染色液,用100ml 蒸馏水洗胶20-60秒。
注意:如果洗胶超过1min会使银离子减少,影响灵敏度。
9.在100ml 的显影液中孵育胶4-8min,直到条带开始出现,想要的条带强度达到。
10. 当适当的染色强度达到后,立刻加
入10ml终止液(stopper)(胶仍然浸没在显影液中)。
轻轻摇动胶10min。
颜色从粉红色到无色说明反应终止。
11. 倒掉终止液,用100ml超纯水清洗胶10min。
银染考马斯亮蓝染色后的胶:
1. 用超纯水彻底的清洗gel 10min。
2.同银染步骤。
可能得到的背景比较深。
快速染色方案:
注意:用微波染色,小心着火,将盖
子盖松些,可以减少着火的概率。
材料:
超纯水、微波染色托盘、微波炉、摇床、塑料棒、10ml一次性管、干净的玻璃杯、刻度量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液(40%乙醇、10%乙酸)用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染:
8*8cm预制胶,1mm厚;用100ml。
1. 电泳后,将胶至于可以微波的容器中,用超纯水清洗干净。
2. 到入100ml 固定液,微波高档(700W)30s。
取出后室温下轻轻搅动
5min。
倒掉固定液。
3. 100ml 30%乙醇洗胶,H档30s。
取出后室温下轻轻摇5min。
倒掉乙醇。
4. 加入100ml 敏化剂,H档30s。
轻轻摇2min。
倒掉敏化剂。
5. 用100ml超纯水洗两次胶,H档30s,摇2min。
6.加入100ml染色液,H档30s。
取出后室温下轻轻摇5min。
7. 倒掉染色液,用100ml超纯水洗20-60s。
不要超过1min!
8. 加入100ml 显影液,直接摇床孵育5min。
(不微波)
9. 当想要的条带出现后,立刻加入10ml 终止液。
轻轻摇10min,颜色从粉色变为无色。
10. 用100ml超纯水清洗10min.
银染脱色计划:(用于质谱)
材料:
干净的手术刀、1.5ml无菌离心管、超纯水。
程序:
1. 银染后,用超纯水彻底清洗。
2. 用手术刀小心的切去感兴趣的条带,并放入1.5ml离心管内。
3. 在gel的空白处切取同样尺寸的胶到离心管内,作为胰蛋白酶消化对照。
4. 加入50ul脱色液A和50ul脱色液B 到每一个离心管内。
(如果你需要处理大量的样品,可以将需要量的A和B 混合,并立即用完,因为A与B混合后不能存放太长时间)
5. 彻底的混合离心管内的成分,在室温下孵育15min. 胶块将缓慢的下降到管底儿。
6. 用一干净枪头吸去上清。
7. 加入200ul 超纯水到离心管内,混合好,室温下孵育10min.
8. 重复6,7步骤两次,进去胰酶消化阶段。
用于质谱的样品:
需要的材料:
测序级别的胰蛋白酶、50mM碳酸氢铵、100%甲醇、30%甲醇、含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈、100mM 包含30%乙腈的碳酸氢铵、浓缩仪、37度水浴、1.5ml无菌离心管。
胰酶消化:(和对照组一起)
1. 使脱色后的gel脱水,用100%甲醇在室温下处理5min.
2. 再用30%甲醇脱水5min
3.用超纯水洗10min 两遍。
4. 用100mM碳酸氢铵(含30%乙腈),洗10min三次。
最后一次洗完后,将胶切成小块,用超纯水洗胶块。
5. 在浓缩仪中干燥胶30min。
6. 用50mM碳酸氢铵重悬碎胶片。
(加入大概5ul buffer/mm2胶)确保溶液可以没过胶。
7. 加入5-10ng/ul胰酶,37度孵育过夜。
8. 用最大转速离心1min,将上清转移到干净的离心管内。
9. 用10-20ul 含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈室温下提取剩余胶中的多肽,最后结合8和9中的提取物。
10. 用浓缩仪浓缩步骤9中的样品至4-5ul。
用于质谱分析。
进行质谱分析:
1. 10ul体积样品浓度为20-50uM。
2. 这个样品应该完成的在超纯水、甲醇或乙腈中。
3. 这个样品必须在<10mM buffer 或盐中。
4. 常用的基质:肉桂酸、对羟基甲苯、芥子酸。
质谱分析后,可以用于查询的蛋白数据库:
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/entrez
•
•
http://www.expasy.ch/tools
page6:样品含有高浓度的DTT:
如果你的样品含有高浓度的DTT(>50mM),银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。
为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品:
1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM,并在70℃加热10min.
2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM,并在70℃加热10min.
3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。
进行电泳,并按手册进行银染。