基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译

基本的银染步骤：（90min）

材料：

超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）

注意事项：

1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。

2.用干净的容器，并标明银染专用。

3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。

4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。

5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。

6.避免试剂交叉污染。

7.用新鲜配置的溶液。

样品含有高浓度的DTT：

如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：

1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.

2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.

3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。进行电泳，并按手册进行银染。

在开始之前：

用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：

程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。

注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。

所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。确保每个胶有100ml的溶液。

1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。

2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。

注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。

3. 倒出固定液，用30%乙醇洗胶10min。

4. 倒出乙醇，加入100ml敏化液，孵育10min.

5. 倒出敏化液，100ml 30%乙醇洗胶10min.

6. 用100ml超纯水洗胶10min.

7. 用100ml 染色液孵育胶15min.

8. 染色完成后，倒掉染色液，用100ml 蒸馏水洗胶20-60秒。

注意：如果洗胶超过1min会使银离子减少，影响灵敏度。

9.在100ml 的显影液中孵育胶4-8min，直到条带开始出现，想要的条带强度达到。

10. 当适当的染色强度达到后，立刻加

入10ml终止液（stopper）（胶仍然浸没在显影液中）。轻轻摇动胶10min。颜色从粉红色到无色说明反应终止。11. 倒掉终止液，用100ml超纯水清洗胶10min。

银染考马斯亮蓝染色后的胶：

1. 用超纯水彻底的清洗gel 10min。

2.同银染步骤。可能得到的背景比较深。

快速染色方案：

注意：用微波染色，小心着火，将盖

子盖松些，可以减少着火的概率。

材料：

超纯水、微波染色托盘、微波炉、摇床、塑料棒、10ml一次性管、干净的玻璃杯、刻度量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：

8*8cm预制胶，1mm厚；用100ml。1. 电泳后，将胶至于可以微波的容器中，用超纯水清洗干净。

2. 到入100ml 固定液，微波高档（700W）30s。取出后室温下轻轻搅动

5min。倒掉固定液。

3. 100ml 30%乙醇洗胶，H档30s。取出后室温下轻轻摇5min。倒掉乙醇。

4. 加入100ml 敏化剂，H档30s。轻轻摇2min

。倒掉敏化剂。

5. 用100ml超纯水洗两次胶，H档30s，摇2min

。

6.加入100ml染色液，H档30s。取出后室温下轻轻摇5min。

7. 倒掉染色液，用100ml超纯水洗20-60s。不要超过1min!

8. 加入100ml 显影液，直接摇床孵育5min。（不微波）

9. 当想要的条带出现后，立刻加入10ml 终止液。轻轻摇10min,颜色从粉色变为无色。

10. 用100ml超纯水清洗10min.

银染脱色计划：（用于质谱）

材料：

干净的手术刀、1.5ml无菌离心管、超纯水。

程序：

1. 银染后，用超纯水彻底清洗。

2. 用手术刀小心的切去感兴趣的条带，并放入1.5ml离心管内。

3. 在gel的空白处切取同样尺寸的胶到离心管内，作为胰蛋白酶消化对照。

4. 加入50ul脱色液A和50ul脱色液B 到每一个离心管内。（如果你需要处理大量的样品，可以将需要量的A和B 混合，并立即用完，因为A与B混合后不能存放太长时间）

5. 彻底的混合离心管内的成分，在室温下孵育15min. 胶块将缓慢的下降到管底儿。

6. 用一干净枪头吸去上清。

7. 加入200ul 超纯水到离心管内，混合好，室温下孵育10min.

8. 重复6,7步骤两次，进去胰酶消化阶段。

用于质谱的样品：

需要的材料：

测序级别的胰蛋白酶、50mM碳酸氢铵、100%甲醇、30%甲醇、含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈、100mM 包含30%乙腈的碳酸氢铵、浓缩仪、37度水浴、1.5ml无菌离心管。

胰酶消化：(和对照组一起)

1. 使脱色后的gel脱水，用100%甲醇在室温下处理5min.

2. 再用30%甲醇脱水5min

3.用超纯水洗10min 两遍。

4. 用100mM碳酸氢铵（含30%乙腈），洗10min三次。最后一次洗完后，将胶切成小块，用超纯水洗胶块。

5. 在浓缩仪中干燥胶30min。

6. 用50mM碳酸氢铵重悬碎胶片。（加入大概5ul buffer/mm2胶）确保溶液可以没过胶。

7. 加入5-10ng/ul胰酶，37度孵育过夜。

8. 用最大转速离心1min,将上清转移到干净的离心管内。

9. 用10-20ul 含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈室温下提取剩余胶中的多肽，最后结合8和9中的提取物。

10. 用浓缩仪浓缩步骤9中的样品至4-5ul。用于质谱分析。

进行质谱分析：

1. 10ul体积样品浓度为20-50uM。

2. 这个样品应该完成的在超纯水、甲醇或乙腈中。

3. 这个样品必须在<10mM buffer 或盐中。

4. 常用的基质：肉桂酸、对羟基甲苯、芥子酸。

质谱分析后，可以用于查询的蛋白数据库：

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/entrez

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http://www.expasy.ch/tools