银染方法总汇及注意事项

ptotocol是这样的，请看哪里不妥：

蛋白银染步骤

步骤溶液时间

固定甲醇100ml

冰醋酸25ml

加双蒸水至250ml 30min

冲洗双蒸水3次

敏化甲醇75ml

戊二醛（25%w/）1.25ml

硫代硫酸钠(5%w/) 10ml

醋酸钠（17g）

加双蒸水至250ml 30min

冲洗双蒸水3次

银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml

甲醛(37%w/) 0.1ml

加双蒸水至250ml 20min

冲洗双蒸水2次

显色碳酸钠(6.25g)

甲醛(37%w/) 0.05ml

加双蒸水至250ml

2-5min

终止EDTA-Na22H2O(3.65g)

加双蒸水至250ml 10min

冲洗双蒸水3次

建议使用silia的方法！！

简单，快！

本人的银染方法：

1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；

2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；

3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；

4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；

5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；

6. 水洗：同上；

7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；

8. 水洗：同上；

9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！

5.2.2.3 银染色

1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％

甲醇500ml 冰醋酸120ml

2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）

甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml

3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%

无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml

4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）

染色步骤：

1 银染液1 洗2次，每次5分钟

2 银染液2 洗1次，每次30分钟

3 超纯水洗2次，每次1分钟

4 0.5%硝酸银洗30分钟

5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色

6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止

我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。但水洗不充分又可能导致背景较深。

我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。

固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水

浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛0.625ml，0.2% NaS2O3•5H2O

银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛

显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛

终止液：1.46% EDTA-2Na•2H2O

silia wrote:

我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：

1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟

2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗

5）加中止液10％乙酸中止即可

银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，对关键操作及要求做了补充！主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究

银染操作规程

实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。

试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛

实验操作程序：

固定：30min或者更长时间

100ml 乙醇40% 乙醇

25ml冰醋酸10% 冰醋酸

加水到250ml

致敏：30min

75ml 乙醇30% 乙醇

17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠

0.5g硫代硫酸钠

加水到终体积250ml

水洗：3 x 10min

银染：20min

0.625g AgNO3

100 ul 37%甲醛（在使用前加入）

加水到终体积250ml

水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)

显色：视情况而定

6.25 g Na2CO3

50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）

加水到终体积250ml

终止：10min

3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸

加水到终体积250ml

保存：1% 冰醋酸，4 ℃

注意事项：

1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。

2．甲醛在使用前加入。

3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。