我们实验室用的银染方法

我们实验室用的银染方法

1.50%甲醇浸泡15分钟(置于摇摆床上,以下省略,本步骤两次,每15分钟更换一次)

2.10%甲醇浸泡10分钟

3.水漂洗3次,每次数秒

4.2μM DTT溶液浸泡20分钟

5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟

6.水漂洗3次,每次不超过15秒(每次约150ML)

7.显色液漂洗3次,每次不超过15秒(每次约100ML)

8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带(约200ML)

9.10G柠檬酸定影

显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水,用前加入250μL福尔马林搅拌均匀

水用双蒸水就可以,纯度越高越好,其他试剂用分析纯,据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏

此方法出自冷泉港蛋白质技术指南(实际上是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方法,但是非常方便,也比其他方法快速,只需要1.5小时,我染出来的胶非常漂亮,有需要的话可以上传给大家看看

一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。

其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净

大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白

1.取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.

2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.

3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.

4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.

显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.

这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.

材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。

液体的量一般是胶体积的5倍，比如13×13×0.1cm的胶，用一百ml一定够，80也行。

我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，

2.0.1% 硝酸银染色10分钟.

3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）

4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，

5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，

6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

我的做法是这样的，染色效果还可以

10%的乙醇固定10分钟，ddH2O洗一次，2分钟。

1%的硝酸脱色4分钟，ddH2O洗两次，每次1分钟。

0.2%AgNO3染色20分钟，ddH2O洗三次，每次1分钟。

NaCO3-甲醛显色至条带出现。

我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差

银染法分以下几个程序：

1、固定

2、敏化

3、银育

4、显影

5、停显

此外，其间还有数步的漂洗程序。

在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。

银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，

为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？

何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。

至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。

对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。

小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以10度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。

请兔子兄将您的大作上传，大家学习学习。

有人建议在显色液中加0.02%的硫代硫酸钠来降低背景，我还未实践，不知牛兄和兔兄有无此经验？

还有灌胶用的玻璃板是否已经洗干净。

染色液:1g硝酸银、1升水

显影液：20g氢氧化钠、0.4g碳酸钠、4ml甲醛、1升水

步骤：1、将要染的胶板用水清洗10—15s

2、放入染色液中摇床轻摇8—10min

3、用水清洗10—15s，再加入少许显影液摇10—15s

4、放入显影液中摇床轻摇5min左右直至条带清晰。

此种方法染出的胶底色淡黄，带清晰。不足之处就是不易保存，在胶干透之前最好拍照或扫描。

固定:１０% 乙醇+０.５%冰醋酸３分钟

染色: ０.２% ＡgNO3 + 10% 乙醇+0.5% 冰醋酸 12分钟

清水漂洗10-15s

显色：3% NaOH + 0.5% 甲醛（用时加）10min左右

对比以后觉得比那个用Na2CO3显色的方法好多了，无论是花费的时间还是银染的效果。呵，传张胶的照片佐证啊！顺便请教一下各位，为什么我跑电泳的时候靠近电极的一端总是比另一端慢呢？电压太高？

你这样显色是不规范的，具体显色步骤如下：

1.2.5.3 银染

（1）固定：将粘胶的玻璃板（胶面向上）置于固定/终止液（10%冰醋酸溶液），振荡20分钟左右至指示剂颜色脱掉为止。

（2）清洗：用蒸馏水振荡洗涤凝胶3次，每次5分钟，凝胶板从水中取出后，竖直控水15秒。

（3）染色：将胶板移至染色液（1gAgNO3溶于1L水，加入37％甲醛1.5ml（用时加）），轻摇35分钟。