蛋白质染色(银染法)标准操作规程

SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项

SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。

2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。

乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。

如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。

3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。

因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。

4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。

6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。

7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。

8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。

10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。

11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。

改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。

12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。

减少巯基乙醇的用量即可避免。

13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。

14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。

15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。

我们做蛋白质电泳的人都知道，银染色很灵敏，有很强的说服力，但通常胶背景较深，不易扫描。

在这里介绍一下低背景的蛋白质银染方法。

AgNO3, 0.075% HCHO(现用现加) 20 min-15 min：说明，此步中洗涤过程要控制好，时间太长，可能显色时间太长甚至染不出色；反之，时间太短，银没有洗干净，背景变深。

DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)

DNA银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：50ml乙醇2、前处理液（敏化液）：5ml HNO33、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5、终止液：50ml 冰醋酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min；2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min；3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S；4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min；5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S；6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S；8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min；10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。

三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板）1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA1、尿素：7.2g2、30%聚丙酰胺，4.68ml3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L)4、30%AP，35ul5、TEMED,4ul四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳12h Treatment24h TreatmentMCT 0 5 10 200 5 10 20Protein银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入）3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5终止液：2g甘氨酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；2、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；3、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化30min；4、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；5、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；6、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；7、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；8、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇10min；9、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。

银染操作步骤

银染操作步骤1. 固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。

固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液，可大量配制室温存放。

2. 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。

3. 水洗涤：（洗2次）弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

4. 增敏：（辅染）现配现用弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。

银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。

银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。

银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。

5. 水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。

弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。

6. 银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。

银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。

银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。

基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译

基本的银染步骤：（90min）材料：超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）注意事项：1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。

2.用干净的容器，并标明银染专用。

3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。

4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。

5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。

6.避免试剂交叉污染。

7.用新鲜配置的溶液。

样品含有高浓度的DTT：如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。

为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。

进行电泳，并按手册进行银染。

在开始之前：用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。

如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。

注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。

所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。

确保每个胶有100ml的溶液。

1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。

2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。

如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。

注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。

长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。

双向电泳凝胶银染操作流程.

2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸）六、（补充）：脱色

蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项

蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项货号：G0180规格：20T有效期：6个月有效。

产品内容：试剂(A):Silver Stain Sensitizer(500×)2×1ml RT试剂(B):Silver Stain(100×)10ml RT避光试剂(C):Silver Stain Developer(5×)2×100ml RT避光试剂(D):Silver Stain Stop Buffer(10×)100ml RT产品说明：蛋白快速银染试剂盒(Protein Fast Silver Stain Kit)是一种快速的可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。

其优点还在于：1、操作简单、快速；2、可用于2D凝胶的银染，并可进行后续的质谱检测；3、目的条带清晰；4、不含甲醇。

Protein Fast Silver Stain Kit与Protein Silver Stain Kit 相比，前者操作速度更快，当检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。

本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：1、水平摇床或侧摆摇床2、去离子水(超纯)3、乙醇、冰乙酸操作步骤(仅供参考)：1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。

整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。

提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。

提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。

2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。

3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。

蛋白质检测操作规程最新

蛋白质检测操作规程最新《蛋白质检测操作规程》一、实验室安全操作规程1. 实验室应具备必要的安全设施，如安全淋浴器，消防器材，急救箱等。

2. 操作人员应穿戴好实验室服装、手套和护目镜，并在操作过程中避免接触有害物质。

3. 实验室内禁止饮食，操作台面应保持清洁整洁，避免交叉污染。

二、蛋白质检测操作规程1. 样品准备：取得待测样品，根据要求进行样品制备，如细胞抽提、蛋白质提取等。

2. 蛋白质浓度检测：采用比色法或荧光法等方法，测定待测样品中蛋白质的浓度，并根据需求稀释样品。

3. 凝胶电泳：将待测蛋白质样品加入凝胶样品槽，进行蛋白质分离，检测蛋白质的分子量。

4. Western blot：将分离的蛋白质转移到膜上，然后用特异性抗体探测需要的蛋白质。

5. 结果分析：根据Western blot结果，判断目标蛋白质的表达情况，经过定量分析，得出相应的实验数据。

三、实验记录和报告1. 操作人员应记录实验的详细过程、使用的试剂和仪器型号、操作步骤、实验数据等内容。

2. 实验完成后，应将实验记录整理成报告，包括实验目的、原始数据、结果分析和结论等部分。

四、仪器设备维护和清洁1. 实验后及时清洁和消毒使用过的实验仪器和设备，确保下次使用前的卫生安全。

2. 定期对实验室仪器进行检查和维护，保证仪器正常使用。

五、结果存档和数据管理1. 所有实验记录和报告要有相应的存档，并按照规定的时间要求保存。

2. 实验数据的管理应该做好备份，并防止数据丢失或篡改。

通过以上《蛋白质检测操作规程》，实验室可按照规程科学、规范的开展蛋白质检测工作，确保实验数据的准确性和实验室的安全运行。

蛋白考染流程

蛋白考染流程蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，它在细胞的结构和功能中起着重要的作用。

为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们发展了许多蛋白质染色的方法，其中最常用的一种是蛋白质的考染流程。

本文将介绍蛋白质考染的基本流程和相关的实验操作。

蛋白质考染的基本流程可以分为样品制备、染色、显微观察和结果分析等几个步骤。

样品制备是蛋白质考染的关键步骤之一。

通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。

提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，常用的方式包括细胞裂解、组织切片和蛋白质纯化等。

提取得到的样品应该保存在适当的条件下，以保持蛋白质的稳定性和活性。

接下来，染色是蛋白质考染流程中的核心步骤。

常用的蛋白质染色方法有几种，包括银染、荧光染和共染等。

银染是一种常用的染色方法，它通过将蛋白质与银离子反应生成可见的银颗粒，从而达到染色的目的。

荧光染色是利用特定的荧光染料与蛋白质结合，并利用荧光显微镜观察染色结果。

共染是将蛋白质与核酸同时染色的方法，可以用于同时观察蛋白质和核酸的位置和分布。

完成染色后，我们需要使用显微镜观察染色结果。

显微观察是蛋白质考染流程中的重要环节，通过观察染色样品的形态和颜色变化，可以初步判断蛋白质的存在和分布情况。

同时，也可以通过显微观察来定量分析染色结果，比如计算染色的强度和分布密度等。

结果分析是蛋白质考染流程中的最后一步。

在结果分析中，我们需要对染色结果进行定量和定性的分析。

定量分析可以通过图像处理软件来完成，比如计算染色的强度和面积等参数。

定性分析则是根据染色结果的特点和分布情况，来推测蛋白质的功能和作用。

总结起来，蛋白质考染流程是一个系统而复杂的实验过程，包括样品制备、染色、显微观察和结果分析等步骤。

通过这个流程，我们可以研究蛋白质的结构和功能，揭示生物体内蛋白质的分布和作用机制。

蛋白质考染的方法和技术也在不断发展和改进，为科学家们提供了更多的工具和手段来研究蛋白质。

希望本文对蛋白质考染流程的理解和实验操作有所帮助。

银染操作步骤(精)

银染操作步骤1. 固定:电泳结束后,取凝胶放入约 100ml 固定液中,在摇床上室温摇动 20分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

固定 40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

固定液的配制:依次加入 50ml 乙醇、 10ml 乙酸和 40ml MilliQ级纯水或双蒸水,混匀后即成 100ml 固定液,可大量配制室温存放。

2. 30%乙醇洗涤:弃固定液,加入 100ml 30%乙醇,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

30%乙醇的配制:70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 30ml 乙醇,混匀后即成 100ml 30%乙醇。

3. 水洗涤:(洗 2次弃 30%乙醇,加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

4. 增敏:(辅染现配现用弃水,加入 100ml 银染增敏液 (1X,在摇床上室温摇动 2分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

银染增敏液 (1X的配制:99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 1ml 银染增敏液 (100X,混匀后即为银染增敏液 (1X。

银染增敏液 (1X配制后需在 2小时内使用。

银染增敏液 (100X的配制:即 2.8%硫代硫酸钠溶液,需用黑袋包裹避光保存。

5. 水洗涤 (共 2次 :弃原有溶液,加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 1分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

弃水,再加入 200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动 1分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

6. 银染:弃水,加入 100ml 银溶液 (1X,在摇床上室温摇动 10分钟,摇动速度为 60-70rpm 。

银溶液 (1X的配制:99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入 1ml 银溶液 (100X,混匀后即为银溶液 (1X。

银溶液 (1X配制后需在 2小时内使用, 最好是现配现用。

银染电泳实验方法

一、实验名称：银染法-电泳检测目标条带
二、实验目的：测定样品中蛋白组成
三、实验材料
1.主要试剂耗材
名称厂家/品牌
30%丙烯酰胺SIGMA
三羟甲基氨基甲烷Amresco
十二烷基硫酸钠（SDS）北京新经科生物技术有限公司
氯化钠北京化工厂
四、实验内容：
A.加样量计算
B.样品定量，浓度计算，吸取等量的待测样品至各EP管中，向管中加入适当体积的5×SDS凝胶加样
缓冲液，100℃加热5min，使蛋白变性。

C.小心拔出上样梳，按预定的顺序加样，上样量根据所选板子的厚度而定，在预留的一个上样孔中
加入分子量Maker
D.样品煮沸10分钟，13000rpm离心5分钟，取上清。

E.开始电泳，电压150V 跑70min。

F.结束电泳，将15%胶拆开固定15min—水洗6min—致敏5min—水洗1min—银染15min—水洗5s—
显色至条带清晰—终止1min后换水保存。

蛋白凝胶电泳银染色实验方法 by HAN

蛋白凝胶电泳银染色实验方法by HANSilver Staining of Protein GelsMaterials∙Protein gel∙45% (v/v) Methanol + 12% (w/v) acetic acid∙5% (v/v) Methanol + 7% (w/v) acetic acid∙10% Glutaraldehyde∙0.01M Dithiothreitol∙Silver nitrate solution∙Sodium citrate / formaldehyde∙Kodak Farmer's Reducer or Kodak Rapid FixerProcedure1.Fix gels by gently rocking them in a solution of 45% methanol / 12% acetic acid untilthe gels are completely submerged. Fix for 30 minutes at room temperature.2.Remove the fixative and wash 2x for 15' each with 5% ethanol / 7% acetic acid. (Gelsthicker than 1 mm require longer washing.)3.Soak the gels for 30 minutes in 10% glutaraldehyde.4.Wash 3x with deionized water, 10 minutes each.5.Place in dithiothreitol for 30 minutes.6.Place in silver nitrate solution for 30 minutes.7.Wash for 1 minute with deionized water.Dispose of used silver nitrate solution immediately with continuous flushing. This solution is potentially explosive when crystals form upon drying.8.Place in sodium citrate / formaldehyde solution for 1 minute.9.Replace the sodium carbonate/formaldehyde solution with a fresh batch, place gels on alight box and observe the development of the bands. Continue to rock gently as the gel develops.10.When the desired degree of banding is observed (and before the entire gel turns black),withdraw the citrate / formaldehyde solution and immediately add 1% glacial aceticacid for 5 minutes.11.Replace the glacial acetic acid with Farmer's reducer or Kodak Rapid Fixer for 1minute. Remove Farmer's reducer and wash with several changes of deionized water. 12.Photograph or scan the gel with a densitometer. demonstrates a typical silver stainedprotein gel.13.For storage soak the gel in 3% glycerol for 5 minutes and dry between dialysismembranes under reduced pressure at 80-82° C for 3 hours. Alternatively, place the wet gel into a plastic container (a storage bag will do) and store at room temperature. Ifdesired, the gels may be dried between Whatman 3MM filter paper for autoradiography, or dried using a commercial gel dryer.2014/8/12 by HAN。

实验十SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）

实验十 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）实验目的1.通过实验了解蛋白质凝胶电泳银染色法的原理。

2.进一步熟悉SDS—PAGE操作，掌握银染色法的实验技术。

实验原理自1979年，Switzer等人提出银染色法后，又经许多学者不断改进，实验表明银染色法较考马斯亮蓝R250灵敏100倍，但染色原理尚不十分清楚，可能与摄影过程中Ag+的还原相似，也可能它对蛋白质分子中氨基酸具有较高的亲和力，从而使蛋白质染成黑色谱带。

试剂与器材(一)、试剂1.牛血清白蛋白（经微量凯氏定氮法测定蛋白含量）溶液准确称量牛血清白蛋白0.5mg，溶于连续系统SDS—PAGE样品溶解液2.5ml中。

2.0.05%考马斯亮蓝R250染色液内含20%磺基水杨酸3.固定液20%三氯乙酸及1%戊二醛各200ml。

4.氨银染色液此液应临用前配制，取0.1mol/LNaOH 20ml、浓氨水 1.4ml，混合摇匀得混合液，取4ml19.4%硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动器皿，全部滴完后用重蒸馏水定容到200ml。

5.显色液此液应临用前配制，取40%甲醛50µL和1%柠檬酸0.5ml，混匀后加重蒸馏水定容至250ml。

6.脱色液(1).称NaCl 37g，CuSO4·H2O 37g,加重蒸馏水850ml,滴加浓氨水至溶液呈澄清的深蓝色,定容至1000ml.(2).称硫代硫酸钠21.8g,加重蒸馏水至100ml,4℃贮存.使用前将(1)和(2)等量混合后稀释30倍.(二)、器材夹心式垂直板电泳槽[凝胶模(135×100×1.0mm)],直流稳压电泳仪(300—600V，50—100 mA)，微量注射器，大培养皿（Φ18cm）。

操作方法(一)仪器安装配制连续SDS—PAGE 10%PAA，制胶后，加入含0.1%SDS的PH7.2 0.1mol/L磷酸盐电极缓冲液。

(二)加样加样量分别为2.5µl，5µl，8µl，10µl。

蛋白质银染原理与方法

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。

注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。

否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。

加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。

室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。

注意观察目的条带。

如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。

显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。

银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。

能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

电泳银染原理

电泳银染原理电泳银染原理1. 介绍电泳银染是一种常用的蛋白质分析技术，可用于检测和定量蛋白质。

本文将从基本原理、操作步骤以及优缺点等方面进行介绍。

2. 基本原理电泳银染基于电泳分离原理，通过电场的作用将蛋白质分离成不同电荷的带点，并利用银离子与蛋白质结合形成可见的银颗粒，从而使分离出的蛋白质区域显现出染色。

3. 操作步骤电泳银染的操作步骤主要包括准备样品、电泳分离、固定蛋白质和银染。

准备样品首先，需要将待分析的蛋白质样品进行制备。

通常包括提取蛋白质、测定蛋白质浓度、标记蛋白质等步骤，确保样品浓度适宜且能与电泳介质配合良好。

电泳分离将准备好的样品加载到准备好的电泳介质中，通常是聚丙烯酰胺凝胶。

施加电场后，蛋白质根据其大小和电荷差异在凝胶中移动，实现分离作用。

固定蛋白质为了增强染色效果，需要将分离出的蛋白质固定在凝胶上。

使用甲醛等试剂固定蛋白质，使其与凝胶交联，以防止后续步骤中的蛋白质流失。

银染银染是电泳银染的核心步骤。

首先，将固定的蛋白质与银离子接触，银离子会与蛋白质中含有的亲银基团发生反应，形成可见的银颗粒。

然后，通过一系列洗涤、显色和停止反应的步骤，实现对银颗粒的增强和可视化。

4. 优缺点电泳银染作为一种常用的蛋白质分析方法，具有以下优点和缺点：优点•灵敏度高，可以检测低浓度的蛋白质。

•分辨率高，能够准确分离不同大小和电荷的蛋白质。

•操作相对简单，不需要使用昂贵的设备。

缺点•染色过程相对复杂，需要掌握一定的技术。

•染色结果呈现一定的变异性，不同实验条件下结果可能有差异。

•对于一些特殊的蛋白质，可能出现较大的染色偏差。

5. 结论电泳银染是一种可靠的蛋白质分析技术，以其高灵敏度和高分辨率备受广大科研人员的青睐。

虽然操作过程相对复杂，但掌握正确的操作步骤和技巧，能够得到准确的结果。

此外，对于染色结果的解读和分析也需要结合实验设计和其他技术手段进行综合评估。

6. 拓展应用除了在蛋白质分析领域，电泳银染还有一些其他的拓展应用。

银染步骤及注意事项

银染步骤及注意事项银染色步骤为1次固定10分钟冰醋酸2用双蒸水洗涤凝胶，每次1分钟3染色液1g硝酸银。

5mL37甲醛1L双蒸水现在匹配染色30分钟。

4.快速清洗并清洗凝胶数次。

5开发30克碳酸钠1.5毫升37甲醛200微升10毫克/升硫代硫酸钠显影直到出现清晰的条纹银染色成功的关键因素包括:1 .用超纯水，如纳米纯水或Milli-Q或双蒸水进行银染色的纯化2.使用提供的碳酸钠或ACS试剂级碳酸钠染色后用于水洗的时间长度非常重要。

清洗胶水，然后将其放入通常浸泡在水中的显色溶液中，只需5-10秒钟。

4使用前及时向显色液中加入甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml5.使用前及时配制染液银染方法有很多种，目前文献报道有100多种。

然而，确切的染色机理还不是特别清楚。

一般原理是银离子在碱性酸碱度环境下还原成金属银，沉淀在蛋白质表面形成颜色。

银染色广泛用于2D凝胶分析和垂直凝胶，用于极低蛋白质含量的测定，因为它对低于1纳克/蛋白质斑点的染色凝胶具有高灵敏度。

本文介绍了我们实验室成功使用的银染色法，以补充关键操作和要求。

主要用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测，如内源GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究。

银染色程序用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白质带上的硝酸银和银离子还原成金属银，在蛋白质带上沉积银颗粒。

染色程度与蛋白质中某些特殊基团的有关。

不含或很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时会被染色。

银染的详细机制尚不十分清楚。

试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或乙二胺四乙酸。

Na2.2H2O，甲醛实验程序固定30分钟或更长时间100毫升乙醇40毫升乙醇25毫升冰醋酸10毫升冰醋酸加水250毫升敏化30分钟75毫升乙醇30毫升乙醇17克醋酸钠28.2克三水醋酸钠0.5克硫代硫酸钠加水250毫升水洗涤3×10毫升银染料20分钟0.625克硝酸银100微升37甲醛加水至最终体积250毫升使用前用水冲洗2×1min注意掌握时间水冲洗时间长颜色慢点是黄色发展取决于情况o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37甲醛添加o 水至最终体积2使用前50ml终止10 min o 3.65 g EDTA、na 2.2h2o 或1g甘氨酸o加水至最终体积250ml保存1冰醋酸4℃注意事项1如果固定时间较长，加一步水洗30分钟以避免胶水太脆而破裂。

银染步骤及注意事项

银染步骤及注意事项银染步骤及注意事项银染色步骤为1次固定10分钟冰醋酸2用双蒸水洗涤凝胶，每次1分钟3染色液1g硝酸银。

5mL37甲醛1L双蒸水现在匹配染色30分钟。

4.快速清洗并清洗凝胶数次。

5开发30克碳酸钠1.5毫升37甲醛200微升10毫克/升硫代硫酸钠显影直到出现清晰的条纹银染色成功的关键因素包括:1 .用超纯水，如纳米纯水或Milli-Q或双蒸水进行银染色的纯化2.使用提供的碳酸钠或ACS试剂级碳酸钠染色后用于水洗的时间长度非常重要。

清洗胶水，然后将其放入通常浸泡在水中的显色溶液中，只需5-10秒钟。

4使用前及时向显色液中加入甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml5.使用前及时配制染液银染方法有很多种，目前文献报道有100多种。

然而，确切的染色机理还不是特别清楚。

一般原理是银离子在碱性酸碱度环境下还原成金属银，沉淀在蛋白质表面形成颜色。

银染色广泛用于2D凝胶分析和垂直凝胶，用于极低蛋白质含量的测定，因为它对低于1纳克/蛋白质斑点的染色凝胶具有高灵敏度。

本文介绍了我们实验室成功使用的银染色法，以补充关键操作和要求。

主要用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测，如内源GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究。

银染色程序用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白质带上的硝酸银和银离子还原成金属银，在蛋白质带上沉积银颗粒。

染色程度与蛋白质中某些特殊基团的有关。

不含或很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时会被染色。

银染的详细机制尚不十分清楚。

试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或乙二胺四乙酸。

Na2.2H2O，甲醛实验程序固定30分钟或更长时间100毫升乙醇40毫升乙醇25毫升冰醋酸10毫升冰醋酸加水250毫升敏化30分钟75毫升乙醇30毫升乙醇17克醋酸钠28.2克三水醋酸钠0.5克硫代硫酸钠加水250毫升水洗涤3×10毫升银染料20分钟0.625克硝酸银100微升37甲醛加水至最终体积250毫升使用前用水冲洗2×1min注意掌握时间水冲洗时间长颜色慢点是黄色发展取决于情况o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37甲醛添加o 水至最终体积2使用前50ml终止10 min o 3.65 g EDTA、na 2.2h2o 或1g甘氨酸o加水至最终体积250ml保存1冰醋酸4℃注意事项1如果固定时间较长，加一步水洗30分钟以避免胶水太脆而破裂。

蛋白质染色(银染法)标准操作规程

蛋白质染色（银染法）标准操作规程1、目的及适用范围检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。

染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。

2、主要仪器摇床、避光盒3、试剂及配制方法乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛，去离子水固定液：100mL乙醇（40%乙醇），25mL冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250mL；致敏液：75mL 乙醇（30%乙醇）17g 乙酸钠，28.2g 三水乙酸钠（34g乙酸钠），0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250mL；银染液：0.625g AgNO3，100 uL37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL；显色液：6.25 g Na2CO3，50 μL 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL；终止液：3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250mL保存液：1% 冰醋酸4、操作步骤4.1固定：50mL固定液中固定30min或者更长时间4.2致敏：50mL致敏液中致敏30min4.3水洗：3 x 10min4.4银染：50mL银染液中染20min （保持避光）4.5水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)4.6显色：50mL显色液中显色，时间视显色程度而定4.7终止：50mL终止液中终止10min4.8保存：1% 冰醋酸，4 ℃5、注意事项5.1 固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。

5.2 甲醛在使用前加入。

5.3 最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。

5.4 显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。

5.5 银染液和显色液需要预冷。

5.6 所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染。

银染方法总汇及注意事项

ptotocol是这样的，请看哪里不妥：蛋白银染步骤步骤溶液时间固定甲醇100ml冰醋酸25ml加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次敏化甲醇75ml戊二醛（25%w/）1.25ml硫代硫酸钠(5%w/) 10ml醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min冲洗双蒸水2次显色碳酸钠(6.25g)甲醛(37%w/) 0.05ml加双蒸水至250ml2-5min终止EDTA-Na22H2O(3.65g)加双蒸水至250ml 10min冲洗双蒸水3次建议使用silia的方法！！简单，快！本人的银染方法：1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。

谢谢！！！5.2.2.3 银染色1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％甲醇500ml 冰醋酸120ml2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）染色步骤：1 银染液1 洗2次，每次5分钟2 银染液2 洗1次，每次30分钟3 超纯水洗2次，每次1分钟4 0.5%硝酸银洗30分钟5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。