掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤
实验二细菌单染与复染
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。 G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍 保留初染时的紫色。
实验二 细菌简单染色法 革兰氏染色法
一、目的要求
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1．巩固油镜的使用方法； 2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细 菌的简单染色法； 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法； 4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
二、实验原理
简单染色法：是利用单一染料对细菌进行 染色的方法，常用碱性染料。只能观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但 不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
革兰氏染色结果及细菌分类
细菌细胞结构
革兰氏染 色阴性
Left: 单菌染色结果 (G+或 G-)
Right: 混合菌染色结果 (G+和 G-)
五、实验结果
文字记录所观察到的革兰氏染色 结果的差别，判断是G－/ G＋。 绘图描述各菌形态（可在一个视 野中）。
六、问题与讨论
1革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？ 实验关键步骤？ 2对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样才能确证你的结论正确？
三、实验材料
变形杆菌、表皮葡萄球菌
载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲 苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套
细菌单染色及革兰氏染色过程观察
BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD 液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
细菌形态结构观察——简单染色革兰氏染色
（1） 为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏 染色？
（2） 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些 操作？哪一步是关键步骤？为什么？
（3） 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操 作正确，结果可靠？
） “和而不同”，多元发展。近年来 ，中医 药在防 治非典 、禽流 感和艾 滋病方 面发挥 的独特 作用也 证实了 二者的 有机结 合，具 有肯定 的临床 疗效。 编辑本段东西方医学交融（df高血压958心脏 病983u6糖尿 病87fr）
1、简单染色法原理 这是最基本的染色方法，由于细性燃料如美蓝、碱性 复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等进行染色。这类染料解 离后，染料离子带正电荷，故使细菌着色。
2、革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色
法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用：
（5） 复染 蕃红染液复染1 min，水洗。 （6） 吸干并镜检 若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应 时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。
五、实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形 态图。 （2） 记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或革 兰氏阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。
（1） 碱性染料 草酸铵结晶紫液。 （2） 媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力， 加强染料与细胞的结合。
（3） 脱色剂 乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。 利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。
（4） 复染液 蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染 上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。
（2） 染色 用草酸铵结晶紫染液染色1 min，用水冲洗。 （3） 媒染 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1 min， 用水冲去碘液。
实验三简单染色法和革兰氏染色法
实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
一般使用碱性染料进行简单染色。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。
3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。
4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
细菌的简单染色和革兰染色实验报告生32 程雨婧2013012406一、实验目的1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制备方法。
2、巩固显微镜油镜的使用方法。
3、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
二、实验原理细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家Christian Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型，是细菌学中最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。
一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经番红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。
除此之外，革兰染色的差异还应考虑物理结构的不同，例如酵母菌虽然是不是细菌，既不是革兰氏阴性菌，也不是革兰氏阳性菌，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S2。
2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。
3、简单染液：结晶紫染液、番红染液。
4、革兰染液：结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液四、实验步骤（一）简单染色1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌的部位在酒精灯火焰上烤一下，可以去除油脂，冷却待用。
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
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简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
01
02
03
04
05
革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
05
实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
03
04
涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
01
02
03
涂片制备
细菌的简单染色和革兰染色
实验三细菌的简单染色和革兰染色一．实验目的1．学习并熟练局部无菌操作2. 学习细菌涂片的制法，掌握细菌简单染色和革兰氏染色的方法3. 进一步熟悉显微镜的使用。
二．实验原理细菌生长时常带负电，所以常用带正电的碱性染料染色。
简单染色就是用一种染料染色的方法。
革兰氏染色可把细菌根据细胞壁成分和结构分为阳性和阴性，阳性菌细胞壁中脂类物质多，染色为紫色；阴性菌细胞壁中脂类物质少，染色为红色。
三．实验材料、仪器与试剂1.菌种：金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌、未知菌，酵母。
2.仪器用品：显微镜、载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，火柴，镊子，擦镜液，吸水纸，牙签3.试剂：简单染液：草酸铵甲紫染液，蕃红染液革兰氏染液：1) 草酸铵甲紫染液；2) 革氏碘液；3) 脱色液；4) 蕃红染液实验前准备（助教完成）将菌种培育24h。
四．实验步骤（一）简单染色1.取载玻片用纱布擦干，在涂菌面反面画直径2mm左右的小圈，把涂菌部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2.涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从EP管中沾取菌液一滴，在洁净无脂的载玻片上涂涂膜。
取菌过程要在酒精灯附近的无菌环境中进行。
3.晾干：让涂片自然晾干。
4.固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5.染色：将固定过的涂片放吸水纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6.水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液7.镜检。
（二）革兰染色。
1.制片：取菌液制成涂片：干燥，固定。
2.初染：滴加1滴结晶紫色染液，1min，水洗。
3.媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
4.脱色：吸去残留水，滴加脱色液至流出液无紫色，立即水洗。
5.复染：滴加蕃红复染3min，水洗。
6.镜检：用吸水纸吸干，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。
注意细菌形态、大小、排列、颜色。
7.拍照。
（三）选做实验往干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片，革兰染色。
实验二细菌的简单染色与革兰氏染色
通过显微镜观察，判断细菌是否着色，从而初步判断细菌的种类。
了解革兰氏染色的原理和操作方法
了解革兰氏染色的原理
了解染色结果
通过使用两种不同的染料，使细菌呈 现不同的颜色，从而区分革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌。
通过显微镜观察，判断细菌是否被染 色以及呈现的颜色，从而确定细菌的 革兰氏类型。
革兰氏染色的目的是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因为这两种类 型的细菌在染色结果上存在明显的差异。
03 实验材料
菌种察。
金黄色葡萄球菌
另一种常见的细菌样本，具有不 同的染色特性。
染色液
结晶紫染色液
用于细菌的简单染色。
革兰氏染色液
用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
简单染色的原理是利用染料对细菌的亲和力不同，将细菌染成不同的颜色，从而区 分不同类型的细菌。
简单染色方法简便、快速，但染色效果不如革兰氏染色。
革兰氏染色原理
革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过使用结晶紫、碘液和酒精 等染料对细菌进行染色。
革兰氏染色的原理是利用结晶紫和碘液对细菌的亲和力不同，将细菌染 成紫色或红色，再通过脱色剂酒精将细菌脱色，最后用番红和碘液复染。
其他试剂和器材
显微镜
用于观察染色后的 细菌。
酒精灯和接种环
用于加热染色液和 接种细菌样本。
无菌水
用于清洗玻片和细 菌样本。
载玻片和盖玻片
用于放置和观察细 菌样本。
吸管和滴管
用于吸取染色液和 其他试剂。
04 实验步骤
细菌的简单染色
01
02
03
涂片制作
将细菌均匀涂在载玻片上， 晾干后进行染色。
染色
出细菌的细胞壁结构特点。
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告（共4篇）
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告(共4篇)细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
、2. 巩固显微镜的使用方法。
基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。
此法操作简单，适用于一般形态的观察。
在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。
带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。
细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。
2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。
革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。
1、细菌的形态结构观察和染色
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 电源 载物台 视场光阑 载物台调节钮
光强调节钮 粗调节器 细调节器 镜座 孔径光阑
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
1. 2. 3.
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10. 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 11. 用低倍物镜，旋转粗调和微调 来进行对焦。 12. 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 13.
实验一 结束
请交报告！
实 验 一
细菌的形态结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理 及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽 孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。
安全事项
微生物 酒精灯
灭菌锅
玻璃器皿
超净台（紫外线）
电器（电炉、微波炉…） ……
实验材料 Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1. 2.
简单染色：草酸铵结晶紫染液。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料 Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 肉膏蛋白胨培养基平板。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿 饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿 使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin， 水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈 现红色。
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
细菌制片及简单染色 涂片：将玻片分成两个区域，各滴上一小滴蒸馏水，再
用无菌操 作的方法挑菌少许枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球
菌于玻 片的水中，并充分混匀涂成薄膜
枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥 固定：涂面朝上，通过微火2-3次 染色：玻片泠却后加结晶紫滴于涂片上，覆盖涂面染色1
双层瓶
香柏油 二甲苯
分钟 水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至洗出水
变无色为止 〔注：勿冲去菌体〕
枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干 镜检：显微镜下观察并记录
四、实验步骤
1、菌落形态观察：
2、➢细注滴菌加意少简：量单水菌染落颜色色：、湿度、形状、大小、透明度 3、、➢➢细染涂颜菌色片色革过→、兰程枯边氏：燥缘→染是固色否定规。→那染么色等〔特1征m。in〕→水洗→枯
二、根本原理〔革兰氏染色〕
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理 ChristainGram氏创立的，可将细菌区分为革 兰氏阳性菌〔G+〕和革兰氏阴性菌〔G-〕 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和
革兰氏阴性，是由这两类细菌细 胞壁的构造和组成不同决定的
三、实验器材与试剂
一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上 二是增加其对染料的亲和力
常用的有加热和化学固定两种方法 固定时尽量维持细胞原有的形
常用碱性染料进展简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及 弱酸性溶液中常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色 局部带正电荷，因此碱性染料的染色局部很容易与微生物细胞结 合使其着色。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红 等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带
正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红
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显微镜保养和使用中的注意事项
1. 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2. 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3. 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以 免压碎玻片或损伤镜面。 4. 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤 害，并且无法进行图像采集。 5. 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同 时聚焦。 6. 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不 能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。
实验内容
（了解鞭毛染色的方法和步骤）
1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上
(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种3～4次，每次培养12～18h， 最后一次培养12～16h。 3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底 部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水面积扩大，然后放平，自然干燥。 4．染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟 后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜 及染液冲洗干净，自然干燥。 镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染 出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。
实验内容
（了解荚膜染色的方法和步骤）
1．制片
加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合， 再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干 燥。 2．固定 滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 3．染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。 无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不 着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片
与镜头之间的空气时，由 于空气与玻片的密度不同， 使光线受到曲折，发生散 射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油 （其折射率与玻片的相 近），则几乎不发生折射， 增加了视野的进光量，从 而使物象更加清晰。
基本原理
(一)简单染色法原理 (二)革兰氏染色法原理 (三)抗酸染色原理 (四)芽孢染色原理 (五)荚膜染色原理 (六)鞭毛染色原理
实 验 材 料Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1.简单染色：草酸铵结晶紫染液。 2.革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。
4．水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。
5．复染 加美蓝染液染lmin。
6．水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成 蓝色。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀 绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染 液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色 lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营 养体呈现红色。
实验内容
(一) 成片观察 (1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和
螺旋菌的形态。 (2)观察四联球菌的形态及排列方式。 (3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮
菌的荚膜的形态。
实验内容
(二)观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 的菌落特征。
5. 用低倍物镜，旋转粗调和微调
作。
来进行对焦。
12. 观察完毕，下降载物台，取下载物台上
6. 调节双目镜筒间距和视度差。
的载玻片，将4×的目镜对准载物台，
7. 再适当调节照明度。
再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦
8. 8. 9.
使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。
镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油， 最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
1. 接通电源。 2. 打开主开关。
10. 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后， 下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，
使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看
3. 转动光强调节钮，使亮度适中。 清物象为止。
4. 把标本固定在载物台上。
11. 换片：另换新片，必须从第9条开始操
蕃红染液复染lmin，用水冲洗
吸干并镜检
实验内容
（了解抗酸染色的方法和步骤）
1．制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取 菌悬液涂片，自然干燥。
2．染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出 现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。
3．脱色 用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。
染色剂和染色原理
微生物染色常用染料如下表：
实验内容
（简单染色的方法和步骤）
涂片
自然干燥 微火固定
染色l min 冲洗 吸干 镜检
实验内容
（革兰氏染色的方法 和步骤）
涂片，干燥、固定
草酸铵结晶紫染液染色lmin，用 水冲洗
用革氏碘液媒染lmin，用水冲去 碘液
用95％乙醇脱色10-30s，至乙醇 液不呈现紫色
实验一 细菌的形态 结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理
及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽
孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 载物台 电源 视场光阑 光强调节钮 粗调节器 载物台调节纽 细调节器 镜座 孔径光阑