免疫组化的经验总结
免疫组化实验技术自我总结
免疫组化技术自我总结一、实验步骤（SABC法）1．动物准备成年SD大鼠用1％戊巴比妥腹腔注射麻醉(剂量1ml/100g)。
2．取材、固定（以取脑组织为例）1) 将麻醉后的动物仰面固定，用水湿润毛皮，暴露心脏。
2) 用剪刀在左心室剪开一道小口，插入灌注针头至主动脉，用止血钳自心室钳紧。
3) 用37℃生理盐水灌注，剪开右心耳，至流出液体变清亮为止。
4) 立即注入Zamboni’s固定液300-400ml(灌注时先快后慢，约15分钟结束。
5) 灌注后剥离脑组织并修块后置于固定液中(6-18h)。
3．玻片处理（可直接购买包被好的防脱载玻片）新的载玻片和盖玻片须经清洁液浸泡12-14h，流水充分冲洗后，蒸馏水清洗5次，入95％乙醇2h以上，用精白布擦干，置切片盒内备用。
用前用硌钒明胶包被或者用0.01％多聚赖氨酸等均匀涂在载玻片上，贴片后入烘箱中烤1-2小时，取出置-20℃冰箱内储存。
4．制片切片前将标本移入30％蔗糖溶液中(用固定液配)，直到标本沉入瓶底。
在标本上滴上OCT，于-70℃快速冻5分钟，后放入-20℃冰冻切片机内50分钟后准备切片，切片后收集在固定液中或0.01M PBS 4℃保存备用，或贴于载玻片上。
5. 抗体特异性检测及阴性对照运用1：50、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500的兔来源的一抗、1：200生物素标记的二抗以及SABC复合物进行免疫细胞化学实验。
一抗对照采用抗原吸收肽、0.01MPBS，二抗对照采用未用生物素标记的IgG以及0.01MPBS。
6．免疫组化1) 贴片或捞片经0.01M PBS漂洗5分钟×3次。
2) 0.3％H2O2，15分钟。
3) 滴加封闭用山羊血清或者0.3% Triton X-100 / 4% BSA封闭液37℃孵育30分钟。
4) 用滤纸吸去多余血清，滴加不同浓度一抗，37℃ 2小时，后入4℃冰箱过夜。
5) 0.01M PBS漂洗5分钟×3次。
免疫组化实验训练小结
免疫组化实验训练小结引言免疫组化实验是一门重要的分子生物学技术，用于检测和鉴定蛋白质、细胞器和细胞膜等在组织或细胞中的分布和表达情况。
通过特定的抗体与目标物质结合，并利用染色反应产生可见的信号来检测感兴趣分子的存在与定位。
在本次实验训练中，我研究了免疫组化实验的基本原理和操作步骤，并对所使用的抗体和细胞进行了染色和观察。
本文将对实验过程、结果和收获进行总结。
实验过程1. 准备样本：收集所需样本，保证其完整性和新鲜度。
2. 样本处理：根据需要，将样本进行固定、解冻、切片等预处理步骤。
3. 免疫反应：将样本与特定抗体进行孵育反应，使抗体与目标物质结合。
4. 洗涤步骤：使用缓冲液对样本进行洗涤，去除非特异性结合的抗体。
5. 二次抗体标记：用与特异抗体结合的二次抗体进行标记，以增加可见信号。
6. 洗涤步骤：再次用缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合的二次抗体。
7. 染色反应：将染色底物添加到样本中，观察免疫反应产生的信号。
实验结果经过实验操作，我得到了如下结果：1. 目标物质在样本中的分布情况：通过观察染色结果，我可以清晰地看到目标物质在细胞膜、细胞质或细胞核等位置的分布情况。
2. 表达定量：通过评估染色强度，可以初步了解目标物质在样本中的表达水平。
3. 抗体的特异性：观察结果可以评估所使用抗体的特异性，确保实验结果的准确性和可靠性。
实验遇到的问题与解决方法在实验过程中，我遇到了一些问题，如失去目标物质的信号、非特异性背景染色的问题等。
为了解决这些问题，我采取了以下措施：1. 优化抗体浓度：尝试不同浓度的抗体，找到最适合的工作浓度。
2. 增加洗涤次数：增加洗涤步骤的次数，以减少非特异性结合的抗体。
3. 更换染色底物：尝试不同的染色底物，选择能够产生明亮和清晰信号的底物。
总结与收获通过本次免疫组化实验训练，我深入了解了免疫组化技术的原理和操作步骤。
在实验过程中，我学会了处理样本、操作免疫反应和观察染色结果的方法。
资料：免疫组化成功的经验和失败的教训汇总
提醒0» »窗体顶端版内版内全站搜索窗体底端1...【原创】免疫组化成功的经验和失败的教训汇总 [精华]丁香园版主2007-09-22 10:37 分享分享到哪里？本人最近已做石蜡切片的免疫组化多次，多是成功的，但也遇到许多预想不到的结果和现象，现汇总问题如下，望高手们参与讨论，给出正确的、完整的、权威答案。
同时也希望大家补充问题，共同交流经验、体会、感悟。
1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。
7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？10. DAB显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10分钟吗？11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？。
相关链接：【整理】免疫组化技术资料大全（原理、步骤、注意事项、教程及常见问题解答）【整理】免疫荧光组织（细胞）化学和免疫胶体金技术大全（原理、试剂和器材、操作流程、常见问题及其解决方法）【原创】免疫组化技术常见问题及其解答集锦票数论文版历年精品荟萃wh2008 edited on 2008-07-20 19:26 •2007-09-22 10:56 分享分享到哪里？丁香园版主针对问题2着色不均匀：1. 脱蜡不充分。
可以60度烤20min，立即放入新鲜的xylene1－2；2. 水化不全。
应经常配制新鲜的梯度乙醇；3. 抗体没混匀。
用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；4. 抗体孵育时，切片放倾斜；5. 抗体孵育后PBS冲洗不充分。
6. 制片厚薄不均匀等问题。
免疫组化主管月总结
免疫组化主管月总结
（原创版）
目录
1.引言
2.本月工作总结
3.本月工作亮点
4.工作中遇到的问题与解决方案
5.下月工作计划
6.总结
正文
一、引言
随着现代生物医学技术的发展，免疫组化技术在疾病诊断、治疗以及科研领域中的应用越来越广泛。
作为一名免疫组化主管，对本月的工作进行总结，以便更好地发现工作中的优点与不足，提高工作效率和质量。
二、本月工作总结
本月共完成了 20 个免疫组化实验项目，涉及 15 种不同的疾病诊断和科研课题。
所有项目均按照规定的时间节点完成，并在规定时间内出具了准确的实验报告。
三、本月工作亮点
1.优化了实验操作流程，提高了实验成功率。
2.引入了新的免疫组化试剂，拓宽了检测范围。
3.对实验室人员进行了业务培训，提高了整体业务水平。
四、工作中遇到的问题与解决方案
1.问题：部分实验结果与预期不符。
解决方案：对实验过程进行仔细审查，发现问题所在，并针对性地调整实验方案。
2.问题：实验室人员对新试剂的使用不熟练。
解决方案：组织培训，加强实验室人员对新试剂的掌握。
五、下月工作计划
1.继续优化实验操作流程，提高实验成功率。
2.对实验室人员进行定期业务培训，提高整体业务水平。
3.对实验室设备进行维护和更新，确保实验质量。
六、总结
通过对本月工作的总结，我们发现在免疫组化实验方面取得了一定的成绩，但仍存在一些问题。
免疫组化经验总结
免疫组化经验总结免疫组化经验总结冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？1、从一抗的选择方面来看。
有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。
2、从研究目的来看。
石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。
3、从抗原的保真性来看。
冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。
4、从操作步骤的繁琐程度看。
染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。
5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。
如何避免荧光素提前衰退？1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。
6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。
普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？1、操作指南：（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。
为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。
免疫组化经验总结第一部分步骤及常见问题
免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。
肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。
2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。
⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。
切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。
（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。
如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。
再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。
但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。
第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。
6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。
滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。
免疫组化总结(猪羊)
免疫组化阶段总结一实验所用试剂配方：1 苦味酸饱和液的配制：1 缓冲液：1×TBS:6.06g TRIS,8.5g NaCL，先加超纯水溶解（约800ml）然后使用pH计调节pH至7.4，定容至1L。
2 抗原修复液：根据Sigma抗体说明书配制。
1×柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/l）：二水柠檬酸三钠2.941g；0.292g EDTA 加超纯水溶解（约800ml），调节pH至6.0，定容至1L。
1×Tris/EDTA：4.84g Tris,3.72g EDTA,加超纯水溶解（约800ml）调pH至9.0, 定容至1L（先加较多NaOH）。
3 细胞通透液：使用超纯水配制0.5﹪Tritonx-100，在100ml 超纯水中加入0.5ml Tritonx-100后轻轻搅拌，尽量不要产生气泡，直至溶解完全方可使用。
4 封闭血清：根据二抗来源选择封闭血清，一般血清来源于二抗来源形同。
血清浓度为10％,TBS配制，或者使用3﹪BSA配制10﹪封闭血清。
5 抗体稀释液：使用TBS配制3﹪BSA。
6 3﹪H2O2：30﹪H2O2，超纯水配制。
7 DAB显色液（试剂盒）配制：1mlTBS中加50mlA液，50mlB 液，充分混匀。
8 荧光二抗的配制：Alexa Flour488、594规格为2mg/ml,说明书建议使用浓度在2ug/ml-10ug/ml之间，所以建议稀释200-1000倍，本实验所使用浓度为5ug/ml，即稀释400倍。
二组织采集与处理材料：取不同时间点猪的睾丸组织观察精原干细胞的表达，新生小猪，3-5月龄,成年猪。
采集适龄猪睾丸组织，置于PBS中带回实验室，用PBS清洗若干次，将睾丸白膜去除，组织切成适宜大小，用苦味酸固定过夜，次日进行清洗（PBS）3-4次，每次30min,然后用70％酒精清洗3次，每次30min，储存于70％酒精备用。
包埋：80％酒精--90％酒精—100％Ⅰ酒精--100％Ⅱ酒精各30 min，无水乙醇：二甲苯1:1 2h，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ依照所取组织大小确定处理时间，二甲苯：石蜡1:1 2h,石蜡Ⅰ1h,石蜡Ⅱ2h，包埋。
免疫组化（总结）
免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。
常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。
免疫组化实战经验总结
免疫组化实战经验总结1、切好的切片最好放在4摄氏度左右冰箱里，抗原较不容易丧失。
把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，还有不正常组织与正常组织要分开。
其余做预实验用。
2、选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。
3、试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。
如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。
4、关于抗体试剂等购买，可多家比较，尽可能询问详细。
最好买下该公司的阳性片。
切记尽可能不要先付钱，等预实验成功后再付，还有尽可能节省，因为会有太多你意想不到的情况，都是需要花钱解决的。
买的量尽可能一次性到位，能省就省，风险大的尽量不要省。
若实验过程有问题，大可尽量与该公司技术部联系，寻求解决方案。
若是怀疑抗体质量问题，可要求换货，态度要强硬，协议流程一次到位，不可被对方牵着鼻子走，否则最终结果只能是浪费时间。
若是抗体浓缩液，个人觉得国内的应该都可以做出阳性来，不是国内买不到的话，可考虑国产的，可便宜很多。
5、每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。
想好可能发生的意外，并先想好补救措施。
6、首次预实验先拿出多张不同的组织切片按最常规的条件进行，若没阳性再拿多张不同组织片（可以与首次相同），条件要适当改进，可先找出一个阳性区域，再深入改进。
7、烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。
切勿把片烤得太久了。
程度刚好，脱蜡效果才会好。
注意做好不同条件的切片标记。
注意温度稳定，再烤片。
8、抗原修复与烤片：温度高低，缓冲系统。
9、二甲苯脱蜡，若是天气太冷，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，同时也可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样会更彻底，效果会更好，若是天气不会太冷，那还是室温下脱蜡，要不可能会适得其反。
时间也是适情况而定。
10、脱水与水化。
酒精梯度不同。
高低相反。
11、甲醛固定会导致蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。
免疫组化（IHC）经验超全总结
免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。
一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
免疫组化的经验总结3
免疫组化的经验总结（3）－操作要点和技巧 生物谷网站1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。
对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
免疫组化总结
免疫组化总结1、酶免疫组化的关键环节1）标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。
固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s 液或mDF 液效果较好。
2）脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。
否则，容易裂片和脱片等。
3）脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。
脱蜡可以先60 度20min，然后立即二甲苯1-3 分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60 度3-4h。
水化用梯度乙醇（由高到低）。
若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4）抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。
修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH 的等）。
我们实验室一般用微波修复中火6min*4 次，效果不错。
注意微波修复后自然冷却30min 左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。
5）细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
一般用Triton X-100、蛋白酶k 等通透液。
如Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
在免疫组织化学（>10um 厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。
同时也是一种去污剂，一般在PBS 中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。
病理切片与免疫组化个人经验总结
病理切片与免疫组化个人经验总结免疫组织化学中对载波片和盖波片的处理（一）载波片的清洁进行免疫组化染色必须保证载波片的洁净否则常导致非特异性染色和组织脱片现象的出现而新的载波片常有油污等可能影响免疫组化染色的异物。
因此必须对载波片进行清洁工作。
常用的载波片清洁液是用重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水以不同比例混合配成不同强度的清洁液。
1．常用清洁液的配制方法：1．1重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=1：1：10重铬酸钾10g., 浓硫酸10ml, 蒸馏水100ml1.2重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：3：251.3重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：5：252载波片的清洁方法1。
1先将载波片用清洁液浸泡12-24h1．2流水冲洗后再用蒸馏水清洗3-5遍1。
3 95%的酒精中浸泡2h，用纱布擦干1．4放入60℃烤箱中烤干或者自然晾干储存在玻片盒内备用（二）载玻片的表面处理在免疫组化试验中由于实验操作步骤的繁多常引起组织切片或者细胞涂片的脱落，影响检测效果，因此常需要用粘附济对切片进行处理。
1APES黏附剂APES是一种新型玻片黏附剂它的黏附剂机制是通过对玻璃表面的化学修饰改变玻璃表面的化学物理特性使组织切片活细胞成分牢固的贴附于玻璃表面不易脱落并可长期保存。
是目前应用最多的组织黏附剂。
1．1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml，混匀即可。
1．2切片处理方法1。
1。
1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min1．1．2浸入APES工作液停留20-30s1．1．3纯丙酮洗2次1。
1。
4放入烤箱37℃过夜1。
1。
5用干净玻片盒装好室温保存备用一般可存放半年以上2多聚赖氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚赖氨酸水溶液是一种良好的组织黏附剂使用浓度在0。
005-0。
01％但是由于价格较高在免疫组化中很少用。
1．1多聚赖氨酸储备液的配制，将0.5g多聚赖氨酸充分溶于100 ml蒸馏水中，4℃或者-20℃保存备用（pll可反复水融）工作液可将pll原液稀释10-50倍使用1。
免疫组化染色质量控制的经验和体会
免疫组化染色质量控制的经验和体会
质量控制是免疫组化染色质的关键步骤，主要用于检查样品的质量和活性，以及染色质抗体的有效性。
1. 样品质量控制：样品的质量对染色质免疫组化的结果有很大的影响，因此样品的质量控制是非常重要的。
在实验前，应当检查样品的质量，确保样品的纯度和活性，避免染色质免疫组化的结果受到影响。
2. 抗体质量控制：抗体的质量也是染色质免疫组化的关键因素，应当在实验前检查抗体的活性和有效性，确保抗体的质量，以保证实验的准确性。
3. 染色质质量控制：染色质的质量也是染色质免疫组化实验中非常重要的一个因素。
在实验前，应当检查染色质的纯度，染色质的纯度越高，染色质免疫组化的效果越好。
总之，免疫组化染色质的质量控制是非常重要的，在实验前应当检查样品、抗体和染色质的质量，确保实验结果的准确性。
最新免疫组化技术总结较好-jane-0115
免疫组化技术总结较好-J a n e-20140115个人免疫组化感悟（Jane）1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化年终总结
免疫组化年终总结在过去的一年中，我们的免疫组化实验室取得了许多令人骄傲的成就和进展。
以下是我们的年终总结：1. 实验方法和技术提升：我们不断努力改进实验室的技术和方法，以确保获得准确可靠的结果。
我们引入了新的抗体和染色剂，优化了染色程序，并且进行了严格的品质控制，以确保实验的有效性和准确性。
2. 创新实验设计：我们积极探索新的实验设计和方法，以应对各种挑战和需求。
我们成功地开展了多重免疫组化染色，进行了细胞定位和表达水平的研究，并尝试了新的标记技术和分析方法。
3. 多学科合作：我们与其他实验室和研究小组展开了广泛的合作，促进了知识的共享和交流。
我们与病理学、分子生物学和临床医学的专家密切合作，共同探索免疫组化在疾病诊断和治疗中的潜力。
4. 科研成果发表：我们的实验室成员积极投稿并成功发表了多篇研究论文，向学术界和科研社区分享了我们的研究成果。
这些成果得到了同行的认可，并为免疫组化领域的进一步研究提供了有价值的参考。
5. 培训和教育：我们注重培训和教育，提高实验室成员的技术水平和科研素养。
我们定期组织内部培训和学术讲座，并积极参与国内外的学术交流会议和研讨会，提升实验室的学术声誉和影响力。
6. 设备更新和维护：我们及时更新和维护实验室的设备，确保实验能够顺利进行。
我们定期检查和校准设备，保持其良好的工作状态，并提供必要的维修和保养服务，以提高实验效率和结果质量。
7. 团队合作和沟通：我们注重团队合作和良好的沟通。
实验室成员之间相互协作，共同解决问题和挑战。
我们定期组织实验室会议和讨论，分享实验经验和技术进展，加强团队的凝聚力和合作精神。
通过这些努力和成就，我们的免疫组化实验室在过去一年中取得了显著的进展，为疾病诊断和治疗领域的研究做出了重要贡献。
我们将继续致力于免疫组化的研究和应用，为人类健康事业做出更大的贡献。
免疫组化(IHC)经验
免疫组化经验总（好假哟）一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80℃的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到 4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2.应用范围的选择。
有的一抗只能用于 WB （ Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3.种属反应性的选择。
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
免疫组化经验总结
免疫组化经验总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，从一些在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。
以免疫组化实验为例来详述。
从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和最终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。
他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。
当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。
此外，我个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的高手一起分享、纠正和补充。
在这里，我需要感谢中华病理网、丁香通、小木虫论坛给我很大的帮助，还有上海舜田生物技术人员花老师给我实验很多指导和帮助，让我受益匪浅。
免疫组化个人感悟：1、其实免疫组化，我个人感觉方法和操作都不是很难，关键是结果出现异常时该如何去解决？我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的，这样你才能大胆地去改革和纠正一些错误的步骤，如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
比如温度有4℃、室温、37℃。
我推荐4℃最佳，反应最温和，背景较浅；而37℃反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
免疫组化经验总结
免疫组化经验总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，从一些在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。
以免疫组化实验为例来详述。
从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和最终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。
他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。
当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。
此外，我个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的高手一起分享、纠正和补充。
在这里，我需要感谢中华病理网、丁香通、小木虫论坛给我很大的帮助，还有上海舜田生物技术人员花老师给我实验很多指导和帮助，让我受益匪浅。
免疫组化个人感悟：1、其实免疫组化，我个人感觉方法和操作都不是很难，关键是结果出现异常时该如何去解决？我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的，这样你才能大胆地去改革和纠正一些错误的步骤，如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
比如温度有4℃、室温、37℃。
我推荐4℃最佳，反应最温和，背景较浅；而37℃反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
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免疫组化的经验总结（1）－常见问题
生物谷网站
免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的为单抗体和多抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是的 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用%%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。
冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他弃之。
为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入%叠氮钠。
抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入%叠氮钠浓度。
大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。
大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）
.: SGP8920 Size: 10ml
Conc.: % w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, %, added as preservative
多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。
也可用于，增加细胞贴壁能力。
[使用说明]
免疫学
操作步骤（可直接在玻片上涂布）
1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
2．用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃3．将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。
注意增加时间不会提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。
[注意]
1．每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。
2．用之前的玻片必须保持清洁。
必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。
4．释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。
5．用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。