酶的化学修饰 前理论后例子

（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
三、设计酶化学修饰的要点
1、了解酶的性质
对酶的活性部位、酶 的稳定条件、酶反应最 适条件及酶的侧链基团 等到的了解。
2、选择修饰剂的类型
修饰剂的分子量、链的长度、对蛋白质的吸附性；修饰 剂上反应基团的数量和位置；修饰剂上反应基团的活化 方法与条件。
一般要求修饰剂具有较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、修 饰剂分子表面有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。
例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基 形成氢键的能力比溴强。
水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基 的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。
（3）静电效应
不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。
碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。 碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄 球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。 组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～ 7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基 团相互影响所致。
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
层.
4）分子内交联：增加酶分子表面基团相 互交联，稳定酶分子；
pK的提高可能是由于这 个 残 基 的 微 区 极 性 降 低 ●5 3 之故。
提示：局部极性的改变对色氨酸、甲 硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小； 对氨基和组氨酸反应性的影响较大； 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性 影响最大。
（2）氢键效应
天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是 使pK发生改变的一个因素。
2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸
的取代，即化学突变法； 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先
用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具 有某种活性的构象；
二、化学修饰的机理
①酶蛋白质功能基团的可反应性； ②修饰剂的可反应性。
适应性； 超反应性由一个或几个因素的综合作用而产生。
（三）修饰剂反应性的决定因素
蛋白质的构象和表面特性对接近氨基酸 侧链功能基的修饰剂也产生有利或不利 的影响。因而对修饰剂也提出了一定的 要求。
1、选择吸附性；
化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选 择性地吸附在蛋白质低或高极性区的。
如：D-氨基酸氧化酶的巯基宜与N-烷基马来酰亚胺的反应， 因为巯基的辛基化速度比乙基化速度高15倍。说明巯基处 在非极性环境中。修饰剂先与蛋白质的巯基疏水键合，然 后烷基化。
5）分子间交联：用双功能或多功能试剂 使不同的酶交联起来产生杂化酶
6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改 善稳定性和免疫性；
7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂 中加表面活性剂与酶形成含水分子的反 相胶团，酶分配在团内的水性环境中， 使酶与有机相分开，避免酶变性。
（2）酶分子内部修饰
1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变 酶动力学性质和酶亲和能力；
二硝基氟苯修饰牛血清白蛋白时，二硝基氟苯先与其疏水 键合。
2、静电相互作用：
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白 质表面带相反电荷的部位。
静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一 个残基定位，或向双功能基的一侧定位。
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3、位阻因素；
蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑 制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功 能基的正常反应。
4、催化因素；
修饰部位附近的其他功能基，如果起一般的酸碱 催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂， 其反应速度和反应部位有明显差异。
如对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的 丝氨酸乙酰化机理相同，但后者反应性差。
5、局部环境的极性：
许多有机反应的速度与溶剂的极性有关， 而有些反应则与极性无关。情况比较复 杂。
（1）微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因 素之一。
如：乙酸在水中的pK为4．76，在80％乙醇中增至6．87， 在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直 接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK 升高。
卵清溶菌酶中第35号谷 氨 酸 的 -C00H 在 25℃ 时 的pK为5.9，而当溶菌酶 与其抑制剂三-N-乙酰氨 基 葡 萄 糖 结 合 后 ， 此 pK 则升至6.4。
SH-CH2-CH2OH
(一)影响酶蛋白功能基团反应性的因素
1、基团定位因素
蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子 基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体 的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。
2、蛋白质局部微区性质的影响
功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的， 而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团 的pK有影响。
（4）位阻效应
处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂 反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使 修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位 阻效应。
如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基 均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对 它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被 修饰。