第四章 酶蛋白的化学修饰
第四章酶分子修饰.doc
酶工程电子教案第四章酶分子修饰教学目标：◆通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
◆通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。
◆通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。
◆酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰, 大分子结合修饰，侧链基团修饰，肽链有限水解修饰，核苷酸链有限水解修饰，氨基酸置换修饰，核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。
教学重点和难点大分子结合修饰的原理和方法；酶分子的定向进化。
教学方法教师讲授为主，结合一次上机实验，加深学生对酶分子结构与功能关系的认识，以及对酶分子修饰方法的掌握。
核酶的内容自学。
1、金属离子置换修饰◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
◆有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。
α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)等。
◆若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。
◆若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。
1.1金属离子置换修饰的方法：◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。
◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤：(1)酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
(2)除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。
(3) 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。
生物化学 第四章 酶
生物化学 第四章 酶1、什么是酶?(酶的定义是什么)?酶的化学本质是什么?(1)酶是由活细胞产生的对特异底物具有高效催化作用的蛋白质和核酸(2) 化学本质：蛋白质2、什么是单体酶?寡聚酶?多酶复合体?多功能酶?单体酶：由一条多肽链构成的酶，溶菌酶；寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶，磷酸化酶a ；多聚复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。
可一次催化连锁反应的复合体，丙酮酸脱氢酶系；多功能酶：一条多肽链上同时具有多种不同催化活性的酶，生物进化中基因融合的产物，DNA 聚合酶3、简述酶的分类?单纯酶、结合酶的定义是什么?酶蛋白、辅助因子的作用? 酶的分类：单体酶、寡聚酶、多酶复合体及多功能酶单纯酶：仅由多肽链组成，如淀粉、脲酶、核糖核酸酶等结合酶：由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，其催化作用依赖于两部分的共同参与，如氨基转移酶、碳酸酐酶、乳酸脱氢酶等。
酶蛋白的作用：决定反应专一性辅助因子的作用：决定反应的种类与性质4、辅助因子的分类及分类依据是什么?各自(辅酶、辅基)的作用分别由哪些? 辅助因子的分类：辅酶和辅基。
分类依据：按照其与酶蛋白结合的紧密程度及作用特点不同辅酶的作用：与酶蛋白共价键结合紧密，不可用透析、超滤方法除去 辅基的作用：与酶蛋白非共价键结合不牢固，可用透析、超滤方法除去5、什么是酶的活性中心?酶的活性中心包括哪些基团?这些基团的功能是什么? 酶的活性中心：酶分子中必需基团相对集中，形成一个与底物特异性结合并催化其反应生成产物的具有特定三维结构的区域。
活性中心的基团 (1)结合基团：可与底物结合(2)催化基团：催化底物发生化学反应6、什么是酶原?什么是酶原激活?酶原激活的机制是什么?简述酶原激活的生理意义?酶原：是细胞内合成或初分泌时处于无活性状态的酶的前体 酶原激活：在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。
酶原激活的生理意义：(1)酶原是酶的安全转运形式，避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。
第四章：酶分子修饰
（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。
Chapter 4 酶分子修饰与应用
第四章酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
2 酶分子修饰的意义？（1）提高酶的活力；（2）增强酶的稳定性；（3）降低或消除酶的抗原性；（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。
第一节酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
2 酶分子主链修饰的意义？（1）可提高酶的活力；（2）可降低或消除酶的抗原性；（3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。
（一）主链的切断修饰①主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
②主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
这样可以提高药用酶的使用价值。
③主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
（二）主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。
在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。
通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。
第二节酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团的意义：（1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。
如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。
2012级名词解释酶工程
名词解释：每章的关键词（英文），就是表达本章中心内容的有实质意义的词汇。
各章重点第一章绪论一、酶工程的概念、分类及其研究内容。
生物酶工程的内容、什么是核酶二、简述酶活力测定方法的原理；酶活力单位；比活力等第二章酶的生物合成与发酵生产一、克隆酶：利用DNA重组技术而大量生产的酶。
二、什么是抗体酶？抗体酶：抗体酶是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。
三、酶生物合成的模式四、一些概念的区别：操纵子与操纵基因、诱导酶与组成酶、胞内酶与胞外酶、产酶动力学五、原核酶合成调节的类型有哪些？六、在酶制剂工业生产中为什么以微生物发酵生产为主？七、如何提高酶的产量？1选育优良的产酶细胞株系（生产组成型酶突变株的筛选，抗分解代谢阻遏突变株的选育，抗反馈阻抑突变株的筛选）2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂第三章酶的提取与分离纯化一、细胞破碎的目的、方法及原理。
二、酶抽提的目的及方法。
三、常用沉淀法的种类及原理。
四、常用沉淀法的种类及原理。
盐析法分离蛋白质的原理。
五、简述酶分离纯化方法及工艺程序的选择策略。
先选用非特异的、低分辨的技术，去除主要的杂质并使酶溶液浓缩；如沉淀、超滤和吸附等。
随后采用高效分离的手段；如离子交换层析、亲和层析。
将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
如凝胶过滤层析。
六、简述影响酶提取的主要因素及影响规律。
抽提溶质的性质（酸性酶宜用碱性溶剂抽提，碱性酶宜用酸性溶液抽提，极性大的酶宜用极性溶剂抽提，含有较多非极性基团的酶宜用有机溶剂抽提。
）。
抽提溶剂的用量（增加用量可以提高酶的提取率。
但是过量的抽提溶剂，会使酶的浓度降低，对酶的进一步分离纯化不利。
用量一般为原料体积的3~5倍，最好分次抽提）温度（提取时温度对酶的提前效果有明显影响。
一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，增大酶分子的扩散速度。
但温度过高易引起酶变性失活，所以提取温度不宜过高。
要根据被抽提酶的酶学性质选择适宜温度）pH 对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
酶的化学修饰法
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。
4酶分子化学修饰2
8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp色 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys
Asp、Glu Arg Cys
His Tyr Trp
氨基
羧基 胍基 巯基 二硫键 咪唑基 酚羟基 吲哚基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘 乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 碘、四硝基甲烷 N-溴代琥珀酰亚胺
素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与
酶分子共价结合。
Hale Waihona Puke 3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。 （四）固定化修饰（共价偶联法）
E－SH ＋
5) 二硫键的化学修饰 还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
氧化：过甲酸:
6)咪唑基的化学修饰 来源：His组 修饰反应:酰基化与烷基化
6.酶的化学修饰
二、修饰剂反应性的决定因素
1.选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自特点选择性的吸附 在低极性区或高极性区，并与蛋白质形成蛋白质-修饰剂 的复合物。一旦复合物形成后，修饰区的速度加强了。这 种速度的加强，部分是由于选择性吸附的结果。
例如,D-氨基酸氧化酶的巯基与一系列的N-马来酰亚 胺的反应表明,巯基的辛基化速度比乙基化速度高15倍. 这说明巯基处在非极性环境中,修饰剂先与蛋白质的巯基 疏水键合，然后烷基化.
N
O
N+HR O C N+HR＇
O—
+
H
C N+ R—
+
H+
pH5
ENZCຫໍສະໝຸດ HX（卤素）ENZ
O
N+HR X O C N+HR＇
C
+ H+
R,R’为烷基， HX 为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶 孙利芹 2013制作
O
ENZ-C-O-
CH3
+
O+ BF4
PH≈5
H3C CH3
O
硼氟化三甲烊盐
ENZ-C-OCH3 + CH3OCH3 + BF4-
微环境（Microenvironment）：由于酶分子
表面外形的不规则、各原子间极性和电荷的不同、 各残基间相互作用的结果，是分子结构的局部形成 一种与酶活性有关的环境。
孙利芹 2013制作
§4.1 化学修饰的原理
基本概念
◆化学修饰：凡能通过化学基团的引入或除去而使蛋
白质共价结构发生改变，称为蛋白质的化学修饰。 ◆选择性化学修饰：指肽链侧链基团被化学试剂专一 性修饰，在较温和的条件下，以可以控制的方式使 一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个 氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。
生物化学-酶
酶一级结构的差别也决定了催化性质的不同， 如胰蛋白酶、 胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶三种蛋白 酶的活性中心Ser残基附近都有一个在立体结构上 的“口袋”状结构。由于三种蛋白酶的口袋”状结 构不同，决定其与不同底物结合即有不同特异性。
酶的特异的三维空间结构是酶催化功能的基础。 酶的二、三级结构是维持酶的活性中心空间构象的 必需结构。
酶的命名包括习惯命名和系统命名，酶可分为六类。 酶与疾病发生、诊断、治疗等密切相关。
➢一、酶的概念 酶是由生物活细胞产生的具有高效催化功能
和高度专一性的一类特殊蛋白质，又叫生物催化 剂•．绝大多数的酶都是蛋白质。
酶的化学本 质是什麽？
酶的概念
• 一、相关概念 • 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。 • 被酶的催化的物质称为底物(S) • 反应的生成物为产物（P） • 酶所具有的催化能力称酶的活性． • 酶失去催化能力称酶的失活．
第四章 酶 (Enzymes)
内容简介
酶是具有高度催化效率及高度特异性的蛋白质。 酶通过多种机制降低反应活化能使反应速率增加。 酶分子一级结构及空间结构是催化功能的基础。 酶促反应速率受到[S]、[E]、pH、T、抑制剂及激活
剂的影响
酶活性可受到别构调节、共价修饰、酶原激活、关键 酶、多酶体系、同工酶等调节
H N C O
COOH CH
R6
氨基酸
氨基酸
消化道中各种蛋白酶的专一性
3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
OH
酶蛋白的化学修饰
一、氨基修饰
采用某些化合物使酶分子侧链上的的氨基发生改变、从
而改变酶蛋白的空间构象的方法
凡能够作用于酶分子侧链上的氨基，产生脱氨基作用或 与氨基共价结合将氨基屏蔽起来的化合物，称为氨基修
饰剂。
如：亚硝酸、2，4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯 （DNS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、苯异硫 氰酸酯（PITC）、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚 胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。
8
第三节 酶的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学方法）使酶的侧链 基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的 修饰方法 作用：
酶学方面：研究酶分子的结构和功能，如：了解酶分 子的构象，研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶 的结构、特性和功能的影响，研究酶的活性中心中的 必需基团，测定某一种基团在酶分子中的数量 酶工程方面：提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低 酶的抗原性，引起酶催化特性和催化功能的改变，提 高酶的使用价值，还可能获得自然界原来不存在的新 酶种
概述
酶分子修饰： 通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改 变酶的某些的特性和功能的技术过程。 作用： 提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的 抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单
位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的 影响。 方法： 酶分子的主链修饰、侧链基团修饰、组成单位置换 修饰、金属离子置换修饰、物理修饰等。
选择吸附
修饰剂根据各自的特点选择性地吸附在低或高极性区
静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电Leabharlann 荷的部位 位阻因素
蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产
酶的化学修饰名词解释
酶的化学修饰名词解释
在生物化学中，酶是一类能够加速化学反应速率的蛋白质，它们起到了催化剂的作用。
酶的化学修饰，指通过化学手段对酶的部分或全部氨基酸残基进行改变，以改变酶的活性、稳定性或选择性。
常见的酶的化学修饰包括：
•磷酸化：在酶的氨基酸残基上添加磷酸基团，调控酶的活性和细胞信号传递。
•糖基化：在酶的氨基酸残基上添加糖基团，参与酶的稳定性和识别特异性。
•乙酰化：在酶的氨基酸残基上添加乙酰基团，影响酶的催化效率。
•甲基化：在酶的氨基酸残基上添加甲基基团，参与基因表达调控。
酶的化学修饰对于生物体的正常功能发挥至关重要，也是研究生物化学和药物开发领域的重要方向之一。
酶分子修饰
第二节
酶分子的修饰方法
• 金属离子置换修饰
• 大分子结合修饰(共价/非共价)
• 侧链基团修饰
• 肽链有限水解修饰
• 氨基酸置换修饰 • 酶分子的物理修饰
1. 酶的金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使
酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离
子置换修饰。
• 但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差， 而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难 以工业化生产。
• 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技 术。 • 定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80 年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获 得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用 的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置 换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。
(1)对巯基的化学修饰：
常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 E-SH + ICHCOOH ----- E-S-CHCOOH + HI
(2)氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯 （PITC)等。
大分子修饰(共价)的过程
• 修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚 糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
• 修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子
酶蛋白的化学修饰.pptx
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys Asp、Glu
氨基 羧基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙 酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
水溶性碳化二亚胺
Arg
胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
Cys
巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺
二硫键 巯基乙醇、DTT
His 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸
修饰酶活性部位的氨基酸残基的试 剂应具备以下特征:
①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②反应在酶蛋白不变性的条件下进行; ③标记的残基在肽中稳定,很易通过降解分离出来,进行鉴定: ④反应的程度能用简单的技术测定。
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2、反应条件的选择
除允许修饰能顺利进行外,还必须满足如下要求： ①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。
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3）肝素
肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性， 适于修饰溶栓酶类以增加疗效。 碳二亚胺法
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5）白蛋白
碳二亚胺法
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第三节 酶的亲和修饰
亲和标记 (Affinity Labeling） 亲和标记是最有意义的一种化学修饰，
这是因为它可以很专一性地作用于酶的活性 部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆 地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该 部位特定基团，一般是必需基团，而造成不 可逆失活。亲和标记修饰剂一般是底物类似 物，和底物含有共同的结合于酶的基团。
2-氯汞- 4-硝基酚
E－SH +
+ HCl
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3）烷基化：
E-SH + R-X
E-SR +HX
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（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
②意义：
A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白 的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性 半衰期短）
B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如： 酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热 失活能力差，容易受产物抑制）
C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过 酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除 酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最 适温度、Km值、催化活性和专一性等)、 扩大酶的应用范围）
四、酶蛋白修饰的方法
（1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定
（即共价固定化酶）；
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
3、酶修饰途径
（1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA 或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的 酶蛋白（蛋白质工程）。 （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中 氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择 性化学修饰）。
三． 酶化学修饰的基本原理
1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
适应性； 超反应性由一个或几个因素的综合作用而产生。
（三）修饰剂反应性的决定因素
蛋白质的构象和表面特性对接近氨基酸 侧链功能基的修饰剂也产生有利或不利 的影响。因而对修饰剂也提出了一定的 要求。
卵清溶菌酶中第35号谷 氨 酸 的 -C00H 在 25℃ 时 的pK为5.9，而当溶菌酶 与其抑制剂三-N-乙酰氨 基 葡 萄 糖 结 合 后 ， 此 pK 则升至6.4。
pK的提高可能是由于这 个 残 基 的 微 区 极 性 降 低 ●5 3 之故。
提示：局部极性的改变对色氨酸、甲 硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小； 对氨基和组氨酸反应性的影响较大； 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性 影响最大。
（2）氢键效应
天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是 使pK发生改变的一个因素。
例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基 形成氢键的能力比溴强。
水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基 的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。
（3）静电效应
第六章 酶蛋白的化学修饰
一、酶的化学修饰
1、概念 凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白
质（酶）共价结构发生改变，从而改变 蛋白质（酶）的某些特性和功能的过程 都可称蛋白质（酶）的化学修饰。
2、酶的化学修饰的目的和意义
①目的：
构象优化、结构稳固
1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2． 作用的最适条件不符。 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 4． 临床应用的特殊要求。
层.
4）分子内交联：增加酶分子表面基团相 互交联，稳定酶分子；
5）分子间交联：用双功能或多功能试剂 使不同的酶交联起来产生杂化酶
6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改 善稳定性和免疫性；
7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂 中加表面活性剂与酶形成含水分子的反 相胶团，酶分配在团内的水性环境中， 使酶与有机相分开，避免酶变性。
2、蛋白质局部微区性质的影响
功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的， 而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团 的pK有影响。
（1）微区的极性
微区的极性是决定基团解在80％乙醇中增至6．87， 在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直 接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK 升高。
不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。
碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。 碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄 球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。 组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～ 7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基 团相互影响所致。
（4）位阻效应
处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂 反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使 修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位 阻效应。
如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基 均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对 它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被 修饰。
二、化学修饰的机理
①酶蛋白质功能基团的可反应性； ②修饰剂的可反应性。
SH-CH2-CH2OH
(一)影响酶蛋白功能基团反应性的因素
1、基团定位因素
蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子 基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体 的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。
（2）酶分子内部修饰
1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变 酶动力学性质和酶亲和能力；
2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸
的取代，即化学突变法； 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先
用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具 有某种活性的构象；