第四章 酶蛋白的化学修饰
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适应性； 超反应性由一个或几个因素的综合作用而产生。
（三）修饰剂反应性的决定因素
蛋白质的构象和表面特性对接近氨基酸 侧链功能基的修饰剂也产生有利或不利 的影响。因而对修饰剂也提出了一定的 要求。
（2）氢键效应
天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是 使pK发生改变的一个因素。
例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基 形成氢键的能力比溴强。
水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基 的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。
（3）静电效应
（2）酶分子内部修饰
1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变 酶动力学性质和酶亲和能力；
2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸
的取代，即化学突变法； 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先
用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具 有某种活性的构象；
四、酶蛋白修饰的方法
（1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定
（即共价固定化酶）；
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
（4）位阻效应
处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂 反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使 修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位 阻效应。
如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基 均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对 它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被 修饰。
（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。
碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。 碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄 球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。 组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～ 7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基 团相互影响所致。
3、酶修饰途径
（1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA 或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的 酶蛋白（蛋白质工程）。 （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中 氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择 性化学修饰）。
三． 酶化学修饰的基本原理
1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
②意义：
A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白 的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性 半衰期短）
B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如： 酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热 失活能力差，容易受产物抑制）
C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过 酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除 酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最 适温度、Km值、催化活性和专一性等)、 扩大酶的应用范围）
第六章 酶蛋白的化学修饰
一、酶的化学修饰
1、概念 凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白
质（酶）共价结构发生改变，从而改变 蛋白质（酶）的某些特性和功能的过程 都可称蛋白质（酶）的化学修饰。
2、酶的化学修饰的目的和意义
①目的：
构象优化、结构稳固
1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2． 作用的最适条件不符。 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 4． 临床应用的特殊要求。
卵清溶菌酶中第35号谷 氨 酸 的 -C00H 在 25℃ 时 的pK为5.9，而当溶菌酶 与其抑制剂三-N-乙酰氨 基 葡 萄 糖 结 合 后 ， 此 pK 则升至6.4。
pK的提高可能是由于这 个 残 基 的 微 区 极 性 降 低 ●5 3 之故。
源自文库
提示：局部极性的改变对色氨酸、甲 硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小； 对氨基和组氨酸反应性的影响较大； 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性 影响最大。
层.
4）分子内交联：增加酶分子表面基团相 互交联，稳定酶分子；
5）分子间交联：用双功能或多功能试剂 使不同的酶交联起来产生杂化酶
6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改 善稳定性和免疫性；
7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂 中加表面活性剂与酶形成含水分子的反 相胶团，酶分配在团内的水性环境中， 使酶与有机相分开，避免酶变性。
2、蛋白质局部微区性质的影响
功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的， 而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团 的pK有影响。
（1）微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因 素之一。
如：乙酸在水中的pK为4．76，在80％乙醇中增至6．87， 在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直 接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK 升高。
二、化学修饰的机理
①酶蛋白质功能基团的可反应性； ②修饰剂的可反应性。
SH-CH2-CH2OH
(一)影响酶蛋白功能基团反应性的因素
1、基团定位因素
蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子 基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体 的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。
（三）修饰剂反应性的决定因素
蛋白质的构象和表面特性对接近氨基酸 侧链功能基的修饰剂也产生有利或不利 的影响。因而对修饰剂也提出了一定的 要求。
（2）氢键效应
天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是 使pK发生改变的一个因素。
例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基 形成氢键的能力比溴强。
水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基 的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。
（3）静电效应
（2）酶分子内部修饰
1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变 酶动力学性质和酶亲和能力；
2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸
的取代，即化学突变法； 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先
用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具 有某种活性的构象；
四、酶蛋白修饰的方法
（1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定
（即共价固定化酶）；
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
（4）位阻效应
处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂 反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使 修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位 阻效应。
如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基 均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对 它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被 修饰。
（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。
碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。 碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄 球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。 组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～ 7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基 团相互影响所致。
3、酶修饰途径
（1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA 或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的 酶蛋白（蛋白质工程）。 （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中 氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择 性化学修饰）。
三． 酶化学修饰的基本原理
1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
②意义：
A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白 的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性 半衰期短）
B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如： 酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热 失活能力差，容易受产物抑制）
C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过 酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除 酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最 适温度、Km值、催化活性和专一性等)、 扩大酶的应用范围）
第六章 酶蛋白的化学修饰
一、酶的化学修饰
1、概念 凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白
质（酶）共价结构发生改变，从而改变 蛋白质（酶）的某些特性和功能的过程 都可称蛋白质（酶）的化学修饰。
2、酶的化学修饰的目的和意义
①目的：
构象优化、结构稳固
1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2． 作用的最适条件不符。 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 4． 临床应用的特殊要求。
卵清溶菌酶中第35号谷 氨 酸 的 -C00H 在 25℃ 时 的pK为5.9，而当溶菌酶 与其抑制剂三-N-乙酰氨 基 葡 萄 糖 结 合 后 ， 此 pK 则升至6.4。
pK的提高可能是由于这 个 残 基 的 微 区 极 性 降 低 ●5 3 之故。
源自文库
提示：局部极性的改变对色氨酸、甲 硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小； 对氨基和组氨酸反应性的影响较大； 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性 影响最大。
层.
4）分子内交联：增加酶分子表面基团相 互交联，稳定酶分子；
5）分子间交联：用双功能或多功能试剂 使不同的酶交联起来产生杂化酶
6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改 善稳定性和免疫性；
7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂 中加表面活性剂与酶形成含水分子的反 相胶团，酶分配在团内的水性环境中， 使酶与有机相分开，避免酶变性。
2、蛋白质局部微区性质的影响
功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的， 而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团 的pK有影响。
（1）微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因 素之一。
如：乙酸在水中的pK为4．76，在80％乙醇中增至6．87， 在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直 接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK 升高。
二、化学修饰的机理
①酶蛋白质功能基团的可反应性； ②修饰剂的可反应性。
SH-CH2-CH2OH
(一)影响酶蛋白功能基团反应性的因素
1、基团定位因素
蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子 基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体 的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。