科技论文

胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究

署名：谢昊

（北京理工大学珠海学院09级生物工程1班）

摘要

胰蛋白酶（trypsin）的分离纯化及动力学研究，是一个综合性设计实验，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备、胰蛋白酶的亲和层析分离纯化、凝胶电泳鉴定及分子量测定、胰蛋白酶的动力学研究等四个部分。最后得出结论，亲和层析法相比于沉淀离心法，分离纯化的效果显著，以及酶的高效性。

◆关键词：胰蛋白酶、CHOM、动力学、亲和层析、凝胶电泳

Ⅰ

目录

摘要

引言

1 胰蛋白酶的亲和配基—鸡卵粘蛋白的分离与定量1.1 CHOM的沉淀分离

1.2 以Bradford法定量蛋白质

1.2.1 标准曲线的制作

1.2.2 样品的测定

2 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶

2.1 亲和吸附剂的制备

2.2 装柱和平衡

2.3 上样和平衡

2.4 洗脱

2.5 数据处理

3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.1 组装电泳槽

3.2 分离胶的选择和装配方法

3.2.1 分离胶的选择，见附录，表C1

3.2.2 分离胶的灌制

3.2.3 浓缩胶的配制和灌制

3.3 样品的处理

Ⅱ

3.3.1 标准蛋白样品的制备

3.3.2 待测样品的制备

3.4 电泳

3.5 染色与脱色

3.6 对结果进行处理分析

4 酶的动力学研究

4.1 酶蛋白含量和酶活力的测定

4.1.1酶液蛋白含量测定

4.1.2 酶活力的测定

4.1.3 数据处理

4.2 胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数Km及最大速率Vm的测定 4.2.1 绘制时间-光吸收关系曲线

4.2.2 胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数Km及最大速率Vm的计算 4.2.3 胰蛋白酶抑制剂的动力学研究

结果处理及分析

结论

致谢

参考文献

附录

Ⅲ

根据鸡蛋的蛋清中，含有胰蛋白酶(trypsin)的专一性抑制剂—鸡卵类粘蛋白（CHOM）。首先以丙酮沉淀CHOM，离心取得蛋白质，并以Bradford method 测定其蛋白质含量。所得的CHOM则作为亲和层析法的专一性配体，以亲和层析法从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶。最后以凝胶电泳检查其纯度及测定其相对分子量。

蛋白质的分离纯化方法很多(沉淀、电泳、层析、透析、超速离心)，为了解较好的分离纯化方法，我主要采取沉淀法和层析法分别对CHOM和胰蛋白酶进行分离纯化，再以凝胶电泳法比较两种方法下纯化的效果来得出结论。并且为了研究酶的动力学问题，结合所学知识，我选取胰蛋白酶通过改变底物浓度及添加抑制剂等操作进行研究。

结合所学知识理论上，蛋白质的分离纯化方法中，亲和层析法较好。酶在不同基质下具有不同的表现情形；酶抑制剂会阻碍酶的表现。

一、通过几组实验验证论点。

1、胰蛋白酶的亲和配基—鸡卵粘蛋白的分离与定量

1.1 CHOM的沉淀分离

a) 从两个鸡蛋中取蛋清50mL于500mL烧杯中；

b) 边搅拌边加50mL TCA-丙酮，调节pH至3.5，继续搅15min，后置4℃冰箱30min；

c)离心5min，取上清液；

d)边搅边加入2体积-20℃预冷丙酮，，再于-20℃静置30min；尽量倒去上清液，下部沉淀离心4-5min（4000-4500rpm）；

e)取出沉淀溶于10mL纯水，调节pH至4.5，然后在4℃下对1L纯水进行透析，理论上1h换一次水；

f)透析后离心10min（6000rpm）；

g)上清边搅拌边加入4倍体积的-20℃预冷丙酮，于-20℃冰箱放置30min；

h)离心6min（6000rmp），倒弃上清，以丙酮洗涤沉淀表面数次，置于通风橱干燥；

i)加5mL纯水轻轻震荡溶解，装入15mL离心管，标记（CHOM），4℃保存。

1.2 以Bradford法定量蛋白质

利用CBG可于蛋白质结合而变色的特性来定量；若样品中蛋白质量多，颜色较深。以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质与光吸收值的标准曲线，来求得所测样品的蛋白质含量。

1.2.1 标准曲线的制作

微量法制作标准曲线加样表（mL）

#0 #1 #2 #3 #4 #5

0.1mg标准蛋

0 0.03 0.09 0.15 0.21 0.27

白溶液

0.15M NaCl 0.3 0.27 0.21 0.15 0.09 0.03

考马斯亮蓝试

3 3 3 3 3 3

剂

混匀，静置10min后以#0为空白对照，在595nm处比色

蛋白质含量0 0.003 0.009 0.015 0.021 0.027

A

0 0.073 0.180 0.258 0.332 0.425

595

标准曲线见附录，图A

1.2.2 样品的测定

样品溶液测定（mL）

#1 #2 #3 #4

CHOM样品溶液0.0005 0.0006 0.0015 0.002

0.15M NaCl 0.2995 0.2994 0.2985 0.298

考马斯亮蓝3000 3000 3000 3000

稀释倍数600 500 200 150

混匀，静置10min后在595nm处比色

0.422 0.548 0.969 1.19

A

595

结合标准曲线，计算得CHOM溶液浓度：52.8mg/mL

（计算公式见附录，式A）

2、亲和层析法分离纯化胰蛋白酶

2.1 亲和吸附剂的制备

a)称取2g甲壳素置于50mL离心管，根据CHOM的浓度，取1.14mL（计算方法见附录，式B1）；

b)补加一定量纯水，使总体积在15mL；

c)加入0.15mL50%戊二醛（计算方法见附录，式B2）；

d)封口后，用漩涡混合器混合均匀；室温下反应45min，不时轻轻上下颠倒，均匀混合；

e)将离心管内溶液完全倒出，加入纯水至40mL，盖上盖子，颠倒混匀，洗涤填料中未吸附的蛋白，然后垂直静置，让填料自然下降，倾倒出上溶液，如此反复多次，至上次溶液没有明显泡沫止；

f)清洗完全后，加入一定量平衡液吸附剂，备用。

2.2 装柱和平衡

a)按蠕动泵的使用方法，将乳胶管装至蠕动泵上，调节；

b)将筛板置于层析柱底部，将乳胶管与层析柱连接，往柱内家约1/4平衡液；调节棘轮及调整泵的转动方向；

c)将2.1中的吸附剂倒入层析柱，让其自然沉降，待沉降完全后，再将另一筛板推至与填料上表面刚好相接触；

d)调节蠕动泵转速，让流速为1mL/min,平衡柱子，收集出口溶液，4mL/管，检测各管于280nm处的吸光度，直至检测到连续2-3跟试管的光吸收值＜0.02，完成平衡。

2.3 上样和平衡

a)调节蠕动泵流速，4s一滴，继续开启蠕动泵将填料上方的平衡液排掉，直至液面和上筛板相切时止；

b)用移液管量取5mL粗酶液（PX），靠层析住内壁流下；

c)开启蠕动泵，以4mL/管收集出口溶液，当PX液面和筛板相切时，暂停泵，