CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化
电荷异质性的成因以及调控策略
电荷异质体的成因-碱性峰
序号 1
产生原因
C端赖氨酸不完全切除 (C-terminal Lys )
2
N端谷氨酰胺环化不完全 (N-terminal Gln )
3
脯氨酸酰胺化 (Proline Amidation)
4
丝氨酸突变成精氨酸 (Ser Mutation to Arg )
影响 CDC 无影响 无影响
免疫原性NGNA的存在，会导致药物在人体使用时引起人体的免疫应答。
电荷异质体的成因-酸性峰
2.天冬酰胺及谷氨酰胺脱酰胺
➢ Asn去酰胺化以及Asp异构化过程； ➢ 脱酰胺化既发生在可变区域，特别是在暴露区域和抗体的互补决定区(CDR)，也发生在
恒定区域。
Asn去酰胺化以及Asp异构化过程
Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody. Josef Vlasak et.2009
影响 PK，ADCC，免疫原性
结合活性，效价 稳定性，效价 稳定性，生物学活性
聚集 结合活性，稳定性，PK
结合活性，效价 生物学活性，稳定性，效价
无影响 未知 未知 未知 未知
电荷异质体的成因-酸性峰
1.唾液酸
➢ 唾液酸上存在负电荷，有助于酸性物质形成。 ➢ NSO 、CHO 、Goat（低） ➢ 以N-乙酰神经氨酸(NANA)的形式和以N羟乙酰神经氨酸(NGNA)形式的唾液酸；主要担忧是
抗体重链C末端修饰示意图 Basic Cp:碱性羧肽酶，PAM：肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶 Lysine clipping：赖氨酸切除 Proline amidation：脯氨酸的酰胺化
CHO细胞基本知识
CHO细胞基本知识引言CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。
CHO细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。
本文将介绍CHO细胞的基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。
来源CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。
经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用的细胞系之一。
现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药行业，特别是重组蛋白的生产。
特点CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。
1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的培养基中生长。
其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。
2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的培养条件下，细胞数量可以迅速增加。
这对于大规模的生物药物生产非常有利。
3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗传和表达稳定性。
这对于生物药物的一致性和稳定性非常重要。
4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗体、生长因子、酶等。
这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。
培养条件CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具有重要影响。
以下是一些常用的培养条件：1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。
培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或人血清蛋白（HSA）等血清成分，以提供细胞所需的营养和生长因子。
2.温度和湿度：CHO细胞通常在37摄氏度的恒温箱中培养，相对湿度约为90%。
温度和湿度的控制对细胞的生长和代谢活性至关重要。
3.pH值：CHO细胞在培养过程中的最适pH值通常在7.0-7.6之间。
采用响应曲面法对Capto adhere填料进行工艺优化
采用响应曲面法对Capto adhere填料进行工艺优化作者：吴光昊何慧丹徐翀颿顾鑫刘彦君来源：《上海医药》2020年第09期摘要为对复合阴离子Capto adhere 填料进行纯化工艺优化，在前期单因素试验基础上，CHO细胞表达的IgG1型单克隆抗体细胞培养上清液经亲和层析纯化后，采用中心复合表面设计（CCF）法优化Capto adhere 填料纯化工艺。
以收率、纯度、HCP清除率为响应变量，考察pH、电导率、载量3个关键因素对纯化工艺的影响，拟合模型并验证。
优化后最佳工艺条件为：pH 7.0，电导率 16.4 ms/cm，载量300 mg/ml，在此条件下，收率、纯度和HCP清除率分别可达（90.77±0.77）%、（99.55±0.05）%和（88.93±2.14）%。
与预测结果偏差均关键词中心复合设计 Capto adhere 抗体纯化中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）09-0067-05Optimization of Capto adhere purification conditions using response surface designWU Guanghao1*， HE Huidan1， XU Chongfan1， GU Xin1， LIU Yanjun2（1. Shanghai Jiaolian Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shanghai 201210，China； 2. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）ABSTRACT In order to optimize the purification process of multimodal anion exchange chromatography media Capto adhere， the purification process by Capto adhere was optimized by central composite surface design method after the cell culture supernatant for the expression of monoclonal antibody IgG1 in CHO cells was purified by affinity chromatography. The effects of three key factors such as pH value， conductivity and load on the purification process were investigated using the yield， purity and HCP removal rate as responses， and then the fitting model was validated. The conditions for optimum process were pH 7.0， conductivity 16.4 ms/cm and load 300 mg/ml. The results showed that the yield， purity and HCP removal rate were（90.77±0.77）%，（99.55±0.05）% and （88.93±2.14）%， respectively. The deviations from the predicted results were all less than 5% and the model was validated. The experimental results show that the optimization of purification process by Capto adhere is effective and feasible.KEy WORDS center composite design； Capto adhere； antibody purification近年來，治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）药物在许多疾病治疗（如癌症）方面扮演着重要的角色，该治疗方法需要在长时间内供给高剂量的抗体[1]。
(完整版)基于CHO细胞的单抗生产2
细胞库的相关法规要求
细胞库的检定
细胞库检定-CHO细胞
检测项目
细胞鉴别 细菌、真菌检查
MCP
+ +
WCP
+ +
分歧杆菌检查
+
+
支原体检查
(+)
(+)
细胞形态观察及血吸附试验
+
+
内 体外不同细胞接种培养法
+
+
、 动物和鸡胚体内接种法
+
-
源 病
逆转录病毒检查
+
-
毒 种属特异性病毒检查（鼠源）
(+)
荧光强度值能反映细胞
目标的相对表达水平
筛选方法
➢ ClonePix
Semi solid media
筛选方法
➢ Limiting dilution
有限稀释法(limiting dilution cloning, LDC)是一种通过梯度稀释以获得单 克隆的方法。 它的应用范围广, 对于大多数细胞类型, 如杂交瘤细胞、 CHO细胞及干细胞等都有较好的克隆分离效果。 LDC的操作过程大致 分为接种(铺板)、 筛选和扩增。 接种的细胞液经过逐级稀释后加到96 孔板中, 每个孔所含的细胞个数理论上不大于1
载体的一般性构成
1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻
CHO细胞无血清培养基的筛选与优化
CHO细胞无血清培养基的筛选与优化CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cell）是一种常用于生物制药工业中的哺乳动物细胞系，用于产生重组蛋白质和抗体。
通过无血清培养基的筛选和优化，可以提高CHO细胞的生长和表达效率，降低生产成本。
1.细胞生长和细胞密度：无血清培养基应该能够支持CHO细胞的生长和扩增，达到较高的细胞密度。
2.细胞存活率和稳定性：无血清培养基应该能够提供足够的养分和适宜的环境条件，使CHO细胞能够保持良好的生存状态和稳定的遗传特性。
3.蛋白质表达水平：无血清培养基应该能够提高CHO细胞的蛋白质表达效率，使其能够产生高水平的重组蛋白质或抗体。
下面是一种无血清培养基的筛选和优化策略：1. 筛选适宜的基础培养基：根据CHO细胞的特性和需求，选择适合细胞生长和表达的基础培养基，如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或CDM（Chromium Depleted Medium）等。
这些基础培养基都是经过优化和完善的，可以满足CHO细胞的基本需求。
2. 添加适宜的生长因子和细胞因子：在基础培养基中添加不同的生长因子和细胞因子，如FGF（Fibroblast Growth Factor）、EGF （Epidermal Growth Factor）等，可以促进CHO细胞的生长和扩增。
根据实验室的需求，可以逐个添加或同时添加这些因子，优化细胞生长和表达的效果。
3.优化细胞培养条件：CHO细胞的培养条件包括温度、CO2浓度、培养皿类型等。
根据CHO细胞的特性和需求，优化这些培养条件，使其适应无血清培养基的环境。
一般来说，CHO细胞的培养温度为37℃，CO2浓度为5%，培养皿选择TC增添剂的培养皿。
4.评估培养基的细胞生长和表达效果：通过细胞计数仪、流式细胞仪等实验手段，评估不同改良培养基对CHO细胞的生长和表达的影响。
比较不同培养基中CHO细胞的生长速率、细胞密度和蛋白质表达水平，选择表现较好的培养基进行优化。
基于脂类代谢的DHFR—CHO细胞培养过程开发与优化
基于脂类代谢的DHFR—CHO细胞培养过程开发与优化作者：蒋金龙范里谭文松来源：《江苏农业科学》2016年第01期摘要：通过对抗体高产（HP）、低产（LP）2个细胞培养过程进行研究发现，2个过程中脂类代谢差异明显。
结果表明，HP中脂类干质量远大于LP过程，且其增速也较快，HP中最大脂类干质量达到（83.70±0.04）×10-9mg/cell，是LP的2.35倍；进一步通过细胞磷脂尼罗红荧光染色检测细胞磷脂含量发现，HP、LP细胞培养过程中细胞磷脂差异显著；随后对3种重要磷脂——磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（Ps）的合成前体A （氯化胆碱）、B（乙醇胺）、C（丝氨酸）、D（胞苷）4种因子通过2水平全析因试验设计进行分析，发现组分A对细胞生长、抗体表达影响极显著（P9 cells·d/L，提高了74.29%；抗体产量为2.04g/L，增加了1.83倍；抗体比生成速率为34.07 mg/（109 cells·d），提高了18.71%。
基于脂类代谢分析，建立了高效经济的细胞培养过程，并为培养基的优化提供了依据，可为后续大规模单克隆抗体工业化生产奠定基础。
关键词：脂类；细胞生长；DHFR-CHO；单克隆抗体；中国仓鼠卵巢细胞中图分类号：S188；Q952.6 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0032—04随着单克隆抗体药物市场的迅速发展，以及对单克隆药物要求越来越高，对于利用动物细胞培养技术生产单克隆抗体药物来说既是机遇又是挑战。
如何在保证细胞高密度培养的同时生产出高产量、高质量的单克隆抗体，将成为细胞培养技术的重点研究课题。
作为细胞培养的关键技术环节，培养过程和培养基的开发、优化尤为关键。
脂类作为细胞膜、线粒体膜等构成的生物膜系统的主要组成部分，对于保证细胞及亚细胞结构的完整性和生物活性有着极其重要的作用，细胞正常运转和存活的先决条件就是这些亚细胞结构具有独立的空间。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则引言：单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是一种由单一细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力，被广泛应用于医学研究和临床治疗。
然而，为了确保单克隆抗体的质量和安全性，需要建立一套严格的质量控制技术指导原则。
本文将详细介绍人用单克隆抗体质量控制技术的原则和方法。
一、生产过程质量控制1. 细胞系的选择和鉴定选择适合的细胞系是制备高质量单克隆抗体的关键。
应选择已经鉴定并验证的细胞系，确保其稳定性和一致性。
常用的细胞系包括CHO细胞和NS0细胞等。
2. 培养条件的优化为了获得高产量和高质量的单克隆抗体，需要对培养条件进行优化。
包括培养基的配方、温度、pH值、气体环境等。
此外，还需要对培养过程中的营养物质和代谢产物进行监测和控制。
3. 细胞培养过程监测监测细胞培养过程中的关键参数，如细胞密度、细胞活力、细胞代谢产物等。
通过定期取样并进行分析，及时发现并解决问题，确保培养过程的稳定性和一致性。
4. 细胞培养过程中的污染控制细胞培养过程中的污染会对单克隆抗体的质量产生严重影响。
因此，需要采取措施防止细菌、真菌和病毒的污染。
包括严格的无菌操作、培养基和培养器具的消毒等。
二、单克隆抗体质量控制1. 抗体纯化和纯度分析单克隆抗体的纯化是确保其质量的重要步骤。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
纯化后，需要对抗体的纯度进行分析，如SDS-PAGE和Western blot等。
2. 抗体活性和特异性检测抗体的活性和特异性是评估其质量的关键指标。
常用的检测方法包括ELISA、流式细胞术和免疫组化等。
通过与目标抗原的结合能力和特异性进行检测，评估抗体的活性和特异性。
3. 抗体稳定性评估抗体的稳定性是其在储存和使用过程中的重要性能之一。
需要对抗体在不同条件下的稳定性进行评估，如温度、pH值和离子强度等。
通过稳定性评估，确定抗体的适宜储存条件和有效期限。
基于CHO细胞的单抗生产PPT
单克隆拍照系统
FDA目前对于单克隆证明方法意见
克隆性
FISH不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传 标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇 具优势。
筛选检定
细胞代次的规定
细胞库的相关法规要求
细胞库的相关法规要求
➢ ClonePix /Cell Xpress TM 克隆筛选及细胞表达系统
➢ Limiting dilution 有限稀释法
筛选方法
➢ Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening
The cold capture method used in FACS where fluorescently labeled antibodies bind to secreted
载体的一般性构成
1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻
译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成 为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必 须依赖于5’端的帽子结构。
2、Promoters：即启动子，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启 动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcription factor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的 抗体序列需使用强启动子如SV40启动子等 而抗性基因需要使用削弱的启动子
基于CHO细胞的单抗生产（第一版）
汪洋 2018/02
目录
• CHO细胞的构建 • CHO细胞的表达 • CHO细胞表达后的产物纯化
CHO细胞表达抗体1
利用超滤膜将抗体从溶液中分离出来，适用于大规模生产中的抗体 纯化。
鉴定技术
1 2 3
ELISA法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的抗体 鉴定技术，通过抗原-抗体特异性结合的原理， 检测抗体的存在和浓度。
Western Blot法
Western Blot是一种将蛋白质从混合物中分离并 检测其特性的技术，适用于抗体特异性和亲和力 的鉴定。
诊断试剂领域
免疫诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于免疫诊断试剂的制备，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，用于检测 生物样品中的特定抗原或抗体。
分子诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于分子诊断试剂的制备，如PCR技术、基因芯片技术等，用于检测生物样品中的特定基 因或蛋白质。
科研领域
抗体库构建
稳定性检测
通过加速稳定性试验等方法检测抗体的稳定 性，确保抗体的长期保存和使用效果。
05
CHO细胞表达抗体的应用
生物医药领域
抗体药物研发
CHO细胞表达的抗体可用于抗体药物 的研发，包括单克隆抗体、双特异性 抗体等，用于治疗癌症、自身免疫性 疾病等。
细胞免疫治疗
CHO细胞表达的抗体可用于细胞免疫 治疗，如CAR-T细胞疗法，通过改造 患者自身的免疫细胞，使其能够特异 性识别并攻击肿瘤细胞。
抗体在科研领域的应用
抗体作为重要的研究工具，可用于研究细胞信号传导、蛋白质相互 作用等生命过程，推动生物医学领域的发展。
02
CHO细胞表达抗体技术
CHO细胞的特点
高效表达
01
CHO细胞具有高效的蛋白表达能力，能够稳定地生产大量的抗无血清培养基中生长，简化了培养过程，降低
金属离子对 CHO 细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响
金属离子对 CHO 细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响张鑫涛;唐红萍;赵亮;范里;刘旭平;缪仕伟;谭文松【摘要】The objective of this work is to get insights into the role of metal ions in the production of the monoclonal antibody(mAb) during Chinese hamster ovary(CHO)cell cultures. Cell growth,antibody production and antibody charge distribution at different concentrations of copper and zinc ions during cell cultures were comprehensively investigated. It was found that 120 nmol/L copper ion and 50μmol/L zinc ion were the optimal concentrations for cell growth and antibody production. Excessively low or high levels of copper and zinc ions brought negative impacts on cell growth and viability maintenance. Additionally,copper ion and zinc ion,as the inhibitor and cofactor of basic carboxypeptidase respectively,showed considerable effects on antibody charge distribution. The medium containing 50 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion was the most conducive to the reduction of charge variants and the increase of main species. Both excessively low or high concentrations of copper and zinc ions led to the increase of the antibody charge variants and the reduction of main species. The concentrations and ratios of copper and zinc ions altered the enzymatic digestion at antibody C-terminal lysine,subsequently affected the content of the basic variant. Additionally,the working space of copper and zinc ions for process control of antibody charge variants was preliminarily discussed. In conclusion,the metal ions play important roles in cell growth,mAb production and mAb charge distribution during CHO cellcultures.%旨在深入认识金属离子在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养生产单克隆抗体过程中所发挥的作用。
cho细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化
cho细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化文章标题：CHO细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化近年来，随着生物制药领域的不断发展，CHO细胞流加培养中抗体片段化的研究与优化成为热门话题。
在本文中，我们将对这一主题进行全面评估，并探讨其深度和广度，以帮助我们更好地理解这一重要领域的发展趋势。
1. CHO细胞流加培养中抗体片段化的意义CHO细胞是生物制药领域常用的重要细胞系，其在生产重组蛋白质方面具有优越性能。
抗体片段化是一种重要的生物制药工艺，可以将全长抗体通过特定酶切割成不同的功能片段，以获得更多的应用价值。
研究和优化CHO细胞流加培养中抗体片段化的过程对于提高生物制药产品的质量和产量具有重要意义。
2. 抗体片段化形成过程的研究在CHO细胞流加培养中，抗体片段化的形成过程受到多种因素的影响，包括基因工程构建、培养条件、酶切割等。
通过对这些影响因素的深入研究，可以揭示抗体片段化形成的机制，从而为优化生产工艺提供理论依据。
3. 抗体片段化形成过程的优化针对抗体片段化形成过程中存在的问题，如酶切位点选择、酶反应条件、副产物的清除等，研究人员进行了大量的优化工作。
通过调控工艺参数和优化分子设计，可以显著提高抗体片段化的效率和产量，从而降低生产成本，促进生物制药产业的发展。
4. 个人观点和理解在我看来，CHO细胞流加培养中抗体片段化的研究与优化是生物制药领域的重要前沿课题，其意义和挑战不容忽视。
通过持续深入的研究和创新，我们有望实现抗体片段化生产工艺的高效、稳定和可控，为生物制药行业的可持续发展注入新动力。
总结回顾本文对CHO细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化进行了全面的评估和探讨，从意义、研究、优化、个人观点等多个角度深入剖析了这一重要课题。
通过本文的阐述，相信读者能更全面、深入和灵活地理解这一主题，为相关领域的研究和实践提供有益的参考和启示。
在知识的文章格式中，以上内容会按照序号标注，并多次提及指定的主题文字“CHO细胞流加培养中抗体片段化”，从而满足文章的要求。
单克隆抗体电荷异构体分离方法优化
介质 SP-FF Nuvia S Eshmuno S Fractogel- SO3 Fractogel- SE Poros XS
表 1 介质动态载量测定
动态结合载量（mg/ml） 13.95 51.79 21.95 18.39 17.31 55.87
粒径（μm） 90 85
75 ~ 95 40 ~ 90 40 ~ 90
385
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-71抗体电荷异构体分离方法优化
程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张弢，王旻
单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一 性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构 体[1]。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途 径，如细胞系及培养工艺[2]，也可能来自于纯化、制剂等制 造过程以及贮存过程的任何阶段[1]。其中由于抗体分子所带 电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构 体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。电荷异 构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带； 离子交换色谱图主峰前后出现小峰。由于这些异构体可能会 影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性 地识别和分离电荷异构体是至关重要的。基因泰克公司曾对 上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代 等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超 过一个 pH 单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学； ②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除； ③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清 除[3]。因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关 键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构 体含量与原研药保持一致。
DBC（mg/ml）=（VA × CO）/VC VA 表示穿透样品紫外吸收值为平台期的 10% 的上样 体积；CO 表示样品蛋白浓度；VC 表示总的柱床体积。 1.2.2 各介质分辨率的考察 取亲和样品用 20 mmol/L
重组单克隆抗体电荷异质性和工艺调控
ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙꎻ ｃｈａｒｇｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙꎻ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ａｎｄ ｐａｙ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍＡｂ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ. Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｓ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ｃｈａｒｇｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ
ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓꎬ ａｎｄ ｍａｙ ｅｖｅｎ ｂｒｉｎｇ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｉｌｌ
ｃａｎ ｃａｕｓｅ ｃｈａｒｇｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅꎬ ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ
支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂及其制备方法和应用
专利名称：支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：夏晚霞,张淑青,王笑非
申请号：CN202010612453.5
申请日：20200630
公开号：CN111849863A
公开日：
20201030
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂，其由以下组分组成：苦瓜多肽、核桃油、大豆卵磷脂、脂溶性维生素、微量元素、氨基酸和水。
本发明还提供了所述培养基添加剂的制备方法和用途。
本发明的培养基添加剂原料来源简单，无动物来源成分，成本低，能够支持CHO细胞高密度生长，单克隆抗体高效表达，延长培养平台期，提高单克隆抗体产量。
申请人：佛山安普泽生物医药股份有限公司
地址：528231 广东省佛山市南海区321国道仙溪段广东生物医药产业基地一期B栋六楼
国籍：CN
代理机构：广州新诺专利商标事务所有限公司
代理人：刘婉
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cho细胞培养知识
cho细胞培养知识【原创版】目录1.CHO 细胞的概述2.CHO 细胞的培养条件3.CHO 细胞的培养方法4.CHO 细胞的培养注意事项5.CHO 细胞培养的应用领域正文【CHO 细胞的概述】CHO 细胞，全称为中国仓鼠卵巢细胞，是一种来源于中国仓鼠卵巢上皮的细胞系。
它们具有较高的生长速度和较强的繁殖能力，被广泛应用于生物学研究和生物制药领域。
【CHO 细胞的培养条件】CHO 细胞的培养需要满足一定的条件，包括适宜的温度、pH 值、气体环境和营养供应。
通常情况下，CHO 细胞在 37℃、pH 值为 7.2-7.4、5% CO2 的环境下生长最为理想。
此外，培养液中应包含足够的氨基酸、核苷酸、维生素和微量元素等营养物质，以保证细胞的正常生长与繁殖。
【CHO 细胞的培养方法】CHO 细胞的培养方法主要包括贴壁培养和悬浮培养两种。
贴壁培养是指将细胞种植在培养皿或培养瓶的底部，使其贴壁生长。
悬浮培养则是将细胞悬浮在培养液中，使其在无附着物状态下生长。
相较于贴壁培养，悬浮培养具有更高的细胞密度和更易于进行规模化培养的优势。
【CHO 细胞的培养注意事项】在 CHO 细胞培养过程中，需要注意以下几点：1.细胞密度：细胞密度过高或过低都会影响细胞的生长。
通常情况下，贴壁培养时细胞密度以 10^6-10^7 个/ml 为宜，悬浮培养时以 5×10^6-10×10^6 个/ml 为宜。
2.传代次数：CHO 细胞在传代过程中，可能会出现染色体异常、基因突变等问题。
因此，应控制传代次数，一般不超过 10 代。
3.污染控制：在培养过程中，需要严格控制外源性污染。
例如，避免使用未经验证的培养试剂，定期更换培养液以清除代谢废物等。
【CHO 细胞培养的应用领域】CHO 细胞广泛应用于生物制药领域，特别是在单克隆抗体制备、基因治疗和细胞疗法等方面具有重要价值。
此外，CHO 细胞还被用于研究细胞生物学、药物筛选、基因表达调控等领域。
CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化
CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被极大重视。
虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体电荷变体的形成原因及相关机制。
前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。
本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。
为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。
通过过氧化氢和AAPH(2,2’-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。
随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。
进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR和无细胞孵育实验显示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。
胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。
CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体的工艺研究
CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体的工艺研究
张婷
【期刊名称】《生物化工》
【年(卷),期】2018(004)006
【摘要】随着科技的不断发展,细胞培养技术在生物医药领域发挥着重要的作用.近年来,单克隆抗体产业在医药发展中占据着重要的地位,而CHO细胞培养表达在单克隆抗体产业中应用极为广泛,其大规模培养工艺的研究已经成为医药领域的热点课题.本文从CHO细胞培养的培养基、主要培养参数及放大工艺三个方面来分析探讨CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体的工艺,以推动单克隆抗体产业的进一步发展.
【总页数】3页(P129-130,133)
【作者】张婷
【作者单位】长春圣金诺生物制药有限公司,吉林长春 130000
【正文语种】中文
【中图分类】TQ460.1
【相关文献】
1.表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化 [J], 刘国庆;陈飞;赵亮;范里;谭文松
2.单克隆抗体生产中CHO细胞培养工艺研究进展 [J], 李未思
3.单克隆抗体生产中CHO细胞培养工艺研究进展 [J], 李未思;
4.CHO细胞大规模培养表达单克隆抗体的工艺研究 [J], 张婷;
5.在CHO-C28细胞大规模培养中提高收获次数及HBsAg的表达 [J], 周长军;金立杰;赵小琳;陈万革;何巍;乔宏雷;杨文冲
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CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化
电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被极大重视。
虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体电荷变体的形成原因及相关机制。
前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。
本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。
为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。
通过过氧化氢和AAPH(2,2’
-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。
随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。
进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR和无细胞孵育实验显
示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。
胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。
本研究结果为将来调控生产过程中抗体电荷异质性的产生、提高抗体药物的产量和质量提供指导。