霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
15版药典与10版药典微生物区别
15版药典与10版药典微生物区别一、微生物计数法1、计数方法（1）平皿法（15版包含平皿法、涂布法）（2）薄膜过滤法（3）MPN法（最可能数法）新增2、计数培养基适用性检查（1）菌种及菌液的制备15版药典新增PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液可以作为稀释液，0.9℅无菌氯化钠同样可以使用。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌增菌由营养肉汤培养基或营养琼脂培养基改为胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基。
白色念珠菌增菌由改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基改为沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度由23～28℃改为20～25℃。
黑曲霉增菌由改良马丁琼脂斜面培养基改为沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度由23～28℃改为20～25℃。
(2)培养基适用性检查10年药典判断依据：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70℅，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
15年药典判断依据：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
3、供试品计数方法适用性试验（1）供试液的制备10年药典制备方法特点：稀释液为PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分类：液体供试品，固体、半固体或黏稠性供试品，需用特殊方法制备供试液的供试品（非水溶性供试品、膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂喷雾剂供试品、贴膏剂供试品、具抑菌活性的供试品）。
15年药典制备方法特点：稀释液为PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，或PH7.25磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基分类：水溶性供试品，水不溶性非油脂类供试品，油脂类供试品，需用特殊方法制备供试液的供试品（膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂喷雾剂供试品、贴膏剂供试品）（2）抗菌活性的去除或灭活15年药典方法比10年药典少了离心沉淀法4、供试品检查（1）检验量10年药典：一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
2015版中国药典检验操作规程
1.1无菌操作要求
? 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包 装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
? 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和 针与杆的连接处。
有毒有菌污物处理要求143涂片染色冲洗片的液体一般可直接冲入下水道强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中经高压灭菌后方可倒入下水道染色的玱片放入5煤酚皂溶液中浸泡24144打碎的培养物立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位浸泡半小时后再擦拭干净
2015年版药典
? 微生物检验规程
1.1无菌操作要求
? 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
1.2无菌间使用要求
? 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放 与实验无关的物品。
? 1.2.2 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于 30min ，使用紫 外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精 棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
? 大肠埃希氏菌 胰酪大豆胨液体培养基
? 沙门菌
胰酪大豆胨液体培养基
2.7.3选择和分离培养
? 2.7.3.1 耐胆盐革兰阴性菌：取相当于 0.1g、0.01g 和0.001g( 或0.1ml 、0.01ml 和 0.001tnl) 供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积 (经方法适用性试验 确定）肠道菌增菌液体培养基中， 30? 3 5℃培养 24? 4 8小时。
中国药典2015版-微生物限度检查解析
菌种的传代、保藏与管理
控制程序
菌种来源
菌种的保 管
菌种的复 活
菌种确认
菌种的储 存和领用
菌种的销 毁及领用 记录
菌种传代、保存、使用及销售记录
菌种名称： 传 代 日 期 菌 种 来 源 菌种编号： 传 代 支 数 菌 种 生 长 培 养 基 培 养 温 度 时 间 保 存 温 度 保管人： 发 出 日 期 发 出 方 式 日期： 购 买 单 位
《中国药典》2015年版-微生物限度 标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合 并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物 限度标准。
标准修订内容
参考欧美日药典标准 <1>修订菌数标准表达方式： 指数形式10ncfu，最大可接受限度值遵守2倍规则： 101cfu： 可接受的最大菌数为 20； 102cfu： 可接受的最大菌数为 200； 103cfu： 可接受的最大菌数为 2000：依此类推。 <2>检查指标： 需氧菌总数：TAMC（替代细菌数）----胰酪大豆胨琼脂培养基 耐胆盐的格兰阴性菌（替代大肠菌群） <3>检查制剂分类： 齿龈、皮肤制剂 原辅料、中药提取物、中药饮片的控制 呼吸道制剂耐胆盐格兰阴性菌的控制
增加新概念
• • • • • 1.MPN法使用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定 2.“分散均匀”：并非一定要溶解 3.偏差调查概念引入 当检验结果出现超常或超标时需要进行偏差调查 调查范围：人、机、料、法、环
控制菌检查法修订解析
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法---新增内 容
2015版药典微生物菌数报告规则
培训老师：何笛
目录
1、《2015版药典》菌数报告规则 2、《食品微生物学检验 菌落总数测定》菌数报告规则
3、菌落计数及报告方法实例：
1、《2015版药典》菌数报告规则
平皿法：
培养和计数：在30～35℃培养3～5 天，沙氏葡萄糖琼脂培 养基平板在20～25℃培养5～7 天，观察菌落生长情 况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。 菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后， 计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规 则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值 不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以 上。
报告方式
38000或 3.8×104
2、若有两个稀释度，其平均菌落数均在0～300个
之间，则取最髙的平均菌落数(见表中例2及例3)
例 子 2 最髙 的平 1/10 1/100 1/1000 均菌 落数 1365 164 20 164 不同稀释度的 平均菌落数 菌落 总数 16400 报告方式 16000或 1.6×104 27000或 2.7×104
4
513000
4、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀
释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时， 以< 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 (见表中例 7)
例 子 不同稀释度的 最低 菌落 平均菌落数 稀释 报告方式 1/10 1/100 1/1000 倍数 总数 ＜1或0 0 0 ＜1 ＜10 ＜1×10
7
5、菌落计数的报告
5.1、菌落数小于100cfu时，按“四舍五入”原则修约，
以整数报告。 5.2、菌落数大于或等于100cfu时，第3位数字采用“四 舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数； 也可以用10的指数形式来表示，按“四舍五入”修约后， 采用两位有效数字。 5.3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌 落蔓延。 5.4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5.5、称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/ml为 单位报告。
2015年版药典微生物修订内容
科
增订了原敷料、中药提取物及饮片的微生物限
度标准。
兴
修订内容
依
1 、菌数计数结果以10n表示；
科
2、 以需氧菌总数取代细菌数。以耐胆盐革 兰
阴性菌取代大肠菌群。
依科制药
分类及其标准
1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌
新 依
的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定 2、 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定
新
依
科
2015版药典微生物修订内容
兴
依 科
一综合车间（二车间）
2015.10
依科制药
微生物计数法主要内容
新 2010版
依
科
细菌数—
兴 营养琼脂培养基
依
科
霉菌和酵母菌数 — 玫瑰红钠琼脂培养基
2015版
1、 细菌数修订为 需氧菌总数。 2、 霉菌和酵母菌数修订为 霉菌和酵母菌总数。 3、 需氧菌总数： 是指胰酪大豆胨琼脂培养基 上生长的 总菌落数(包括真菌菌落 数） 。 4、 霉菌和酵母菌总数： 是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数(包括细菌菌落数) 。 若为因 沙 氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母 菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含 有抗生素的（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄 琼脂培养基或其它选择性培养基（如玫瑰红钠琼 脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
依
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（ SDA）
科
依科制药
新 修订后
依
耐胆盐的革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、
科
铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色
念珠菌
兴
修订前
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基↓制备成1:10供试液。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
微生物限度检验操作规程
1 目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠2 依据《中国药典》 2015 版。
3 范围本标准适用于微生物限度检验。
4 责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作5 程序5.执行标准：《中国药典》 2015 版。
15.抽样：照《取样标准操作规程》进行26 内容6.需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数1计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
6.1.1 设备、仪器及用具6.1.1.1 设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30〜35°C）、生化培养箱（20〜25°C）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2 试液6.1.2.1 消毒液A ．0.1% 新洁尔灭溶液B. 75聽醇溶液6.1.2.2 稀释液、试剂及配制A. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾 3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml,微温溶解，滤清，分装，121°C灭菌15分钟。
B. 聚山梨酯80C. 无菌十四烷酸异丙酯D. pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3 培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4 操作方法6.1.4.1 试验前准备6.1.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（ 1ml、 10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
2015版中国药典微生物限度记录
培养基的储藏
琼脂培养基不得在 0 ℃ 或 0 ℃ 以下存放，防止冷冻破 坏凝胶特性。
琼脂培养基最好现用现配，如置冰箱保存，一般不 超过一周，且应密闭包装，若延长保存需经验证 确定。 培养基灭菌后应立即取出，不得储存在高压灭菌器 中。
培养基适用性试验
修订内容
控制菌检查用培养基数量减少 7个，在增菌过程中， 使用无选择性增菌培养基。
2.一次只可加0.1-0.2ml样品。
薄膜过滤法
1.孔径应不大于0.45微米。直径一般为50mm，若采用其他直 径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。 2.滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截 留。 滤器注意点 1.滤器及滤膜在使用前应采用适宜的方法灭菌。 2.使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。 4.油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 5.供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免 滤膜上的微生物受损伤。
理由：
污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损 伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的 细胞得到修复，提高检出 配制的培养基的适用性检查 促生长能力、抑制能力和指示特性 的检查。
实验菌株的管理使用及鉴定
菌种的保藏 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物 的代谢和生长繁殖，因此，低温、干燥和真空是菌种保藏 的重要手段。
（三）2015版药典微生物检查法修订内容——计数法
修订前
细菌数——营养琼脂 霉菌及酵母菌数——玫瑰红钠琼脂 修订后 需氧菌总数——胰酪大豆胨琼脂（TSA）
霉菌及酵母菌总数——沙式葡萄糖琼脂（TSB）
2015药典纯化水注射水检验标准
本品为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任何添加剂。
纯化水为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任何添加剂。
酸碱度:取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色;硝酸盐取本品5ml置试管中，于水浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml 与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得（每1ml相当于1ugNO3）]0.3ml,加无硝酸盐的水4.7ml,用同一方法处理后的颜色比较,不得更深（0.000006%）；亚硝酸盐取本品10ml，置纳氏管中，对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）1ml与盐酸萘乙二胺溶液(0.1→100)1ml，产生粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠0.75g（按干燥品计算），加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成50ml，摇匀，即得（每1ml相当于1ugNO2）]0.2ml，加无亚硝酸盐的水9.8ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000002%）；氨取本品50ml，加碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液（取氨化铵31.5mg，加无氨水适量使溶解并稀释成1000ml）1.5ml，加无氨水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深（0.00003%）；总有机碳不得过0.50mg/L（0.5ppm 、500ppb）（通则0682 2015版药典第四部 P85）易氧化物取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液(0.02mol/L)0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失；以上总有机碳和易氧化物两项可选做一项不挥发物取本品100ml，置105℃恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，并在105℃干燥至恒重，遗留残渣不得过1mg；重金属取本品100ml，加水19ml，蒸发至20ml，放冷，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml与水适量使成25ml，加硫代乙酰胺试液2ml,摇匀，放置2分钟，与标准铅溶液1.0ml加水19ml用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000 01%）；电导率（10℃，≦3.6µs/cm），（20℃，≦4.3µs/cm），（25℃，≤5.1µs/cm）（通则0681 2015版药典第四部P84）；微生物限度取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录ⅪJ），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个（通则1105 2015版药典第四部P140）。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
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霉菌与酵母菌计数方法
1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)
白色念珠菌(0)代
↓
传代培养
↓
实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养
基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天
↓
计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,
培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu
↓
计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温
度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基
1.１菌种
试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)
取白色念珠菌得新鲜培养物
↓
用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液
取黑曲霉得新鲜培养物
↓
加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无
菌氯化钠溶液,将孢子洗脱
↓
采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内
↓
用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯
化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液
菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、
1。
３阴性对照
为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、
2、培养基适用性检查
按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板
↓
置表１规定条件下培养
↓
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿
↓
同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验
↓
被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试验
菌应生长良好
3计数方法适用性试验
供试液制备:水不溶性非油脂类供试品
↓
取供试品,用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或pH7。
2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨
液体培养基
↓
制备成１:10供试液。
↓
若需要,调节供试液ｐH值至6~8。
必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释、
⒉接种与稀释
所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％、为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。
供试液接种后,按下列“微生物回收"规定得方法进行微生物计数。
若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值小于菌液对照组菌数值得50％,可采用下述方法消除供试品得抑菌活性、
⑴加稀释液或培养基体积、
⑵入适宜得中与剂或灭活剂
⑶采用薄膜过滤法。
5供试品中微生物得回收
表1所列得计数方法适用性试验用得各试验菌应逐一进行微生物回收试验、微生物得回收可采用平皿法、薄膜过滤法或ＭPN法。
(预方法就是平皿法)平皿法包括倾注法与涂布法。
表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿,以算术均值作为计数结果。
(１)倾注法
取照上述“供试液得制备”、“接种与稀释”与“抑菌活性得去除或灭
活"制备得供试液1ｍl
↓
置直径90mm得无菌平皿中
↓
注入1５～20mｌ温度不超过
４5℃熔化得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基
↓
混匀,凝固,倒置培养、(若使用直径较大得平皿,培养基得用量应相应增加)
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组得平均菌落数。
(2)涂布法
取15～20ｍl温度不超过45℃得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂
培养基↓
注入直径9０ｍm得无菌平皿,凝固,制成平板
↓
采用适宜得方法使培养基表面干燥(若使用直径较大得平皿,培养基用量也应相
应增加)↓
每一平板表面接种上述照“供试液得制备”、“接种与稀释"与“抑菌活性得去除或
灭活”制备得供试液不少于０。
１ml
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组得平均菌落数
6、结果判断
计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值与菌液对照组菌落数得比值应在0.5~2范围内验均符合要求,照所用得供试液制备方法及计数方法进行该供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数。
7、供试品检查
(１)除另有规定外,一般供试品得检验量为10g或10ml;
(２)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数;沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌与酵母菌总数。
(3)培养与计数除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~３5℃培养３～5天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天,、
(4)菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于3００cfｕ得稀释级、霉菌与酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于1０0cｆu得稀释级。