亲和层析法

亲和层析载体的组成 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。
原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作 为固定相吸附剂；
当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和 固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合， 其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出；
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。
金属离子亲和层析
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基， 如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利 于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸 的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子 亲和层析得到分离。
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。
依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：
① 正确地预计被设计的配体构像
② 正确预计配体的亲和力
优良配体须具备的条件：
① 与待纯化的物质有较强的亲和力。
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 不利的。
➢ 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大 分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。
通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合 适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、 偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
②具有与基质共价结合的基团
与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。
③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。
④配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的 条件，可以多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性
配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
➢ 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合 的配体。如生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶 性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
2、亲和作用的机理
结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键 等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离 子、螯合剂等。
亲和层析法
主要内容
亲和层析法的基本介绍 制备方法 操作过程
亲和层析法的应用
1、生物亲和作用
生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种 识别并结合的能力，能区分结构和性质非常相近的其它分子。如蛋 白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体等体系。
由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解 决这一问题，一种有效的分离方法应运而生——亲和层析(Affinity Chromatography，AC)，利用被分离的生命大分子物质和特异性 配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。
主要内容
亲和层析的基本原理 制备方法 操作过程
亲和层析的应用
1、操作流程
层析前：制备亲和层析剂
选择
根据欲分离物质特性
配基
选择
根据配基分子大小及基团特性
载体
偶联 亲和层析剂
3、特点
优点：上样量大，纯化过程简单、迅速，且分离效率 高，被分离物质的活性不易丧失。特别适用于分离纯 化一些含量低、稳定性差的生物大分子。
缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将 其制备成固相载体，在洗脱中，交联在层析介质上的 配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如 抗体、染料等配基。成本相对较昂贵。
4、亲和层析的分类
特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子 物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸 附特异性强，结合力大。
通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质 （如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高 的吸附容量，但分辨率不及前者。
5、亲和层析的类型
根据配体与生物大分子之间相互作用体系不同，可以把亲和层析分 为：
拟生物亲和层析
利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程 亲和层析的应用
1Hale Waihona Puke Baidu载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载
体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。
例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
生物亲和层析
利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常 具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受 体等。
免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统。广泛 应用于许多以单克隆抗体作为亲和配体的典型蛋白质纯化。 用免 疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于 检测含量低微的样品。