关于重组人血白蛋白的系统性表述

关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。

随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。

根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。

但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。

用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。

一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。

2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。

3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。

（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。

因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。

（2）酵母表达系统酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。

研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)等。

在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mg rHSA。

毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。

毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。

（3）其他表达系统作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。

就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。

2000年黄淑帧等通过乳腺表达载体构建、显微注射、卵母细胞体外成熟和受精以及整合胚移植等技术成功将HSA基因整合入牛体内，转基因牛研制的总有效率为12.5%。

rHSA在老鼠的乳腺中也得到了成功表达且分泌量较高，达到11.9g/L。

但该表达系统存在病毒及朊病毒污染的风险，在产业化之前还有很多困难需要克服。

国内外也有转基因植物生产rHSA，但是该系统要实现产业化，需要克服植物合成的非人类糖可能导致免疫原性、田野或温室等标准操作规范等问题。

（4）各种系统表达重组人血白蛋白的比较4.与HSA相比的相对优势目前该技术主要以酵母做为蛋白表达式生产，具有以下显著特征：一是，rHSA与HSA的结构一致，临床疗效也相同。

二是，rHSA是利用现代生物发酵技术生产的白蛋白产品，不仅可提高产品的纯度，而且其质量明显优于血源提取物。

三是，采用基因重组方法生产白蛋白可实现大规模工业化生产，产量不受资源限制，从而降低白蛋白的生产成本。

四是，无动物源，可以有效避免人血白蛋白携带病毒等风险。

5.rHSA的技术难点rHSA 的纯化不同于pHSA 等血浆蛋白及其它的重组蛋白，主要在于：1）纯化体系复杂。

rHSA 是通过酵母发酵生产的，由于发酵液中含有大量的酵母细胞组分和分泌物，如蛋白酶，杂蛋白，脂肪酸，核酸，多糖，色素，热原物质等。

如果不及时去除发酵液中的蛋白酶，rHSA 就会被降解终；产物中如果含有酵母细胞组分，哪怕只有很少很少的含量，输入人体内转化为抗原，对于这种不同物种之间的相互作用，会对人体产生很大的危害。

2）纯度要求非常之高。

对于像疫苗这样需要微量输入的重组蛋白质来说，99.999 %的纯度已经足够，但对于rHSA 达到这样的纯度程度还是不够的，即使有很微量的有害杂质将可能产生致命的危险。

rHSA 的纯度要大于>99.999999%。

3）要想在市场上立足，rHSA 的成本必须低于pHSA 才行。

其中rHSA 的纯化成本占生产总成本的大部分。

所以要实现大规模生产，降低纯化成本是根本。

由此可见，rHSA 走向工业化并商业化的两大难点--成本和质量(即纯度) 将是对rHSA 纯化技术需解决的问题。

二、主要应用领域（1）作为临床急救药物，白蛋白在危急情况下能够使血液体积得到扩充，在慢性肝疾病患者、烧伤病人、急性细菌性腹膜炎、急性出血性休克病人中输注白蛋白溶液都取得了很好的疗效。

另外，白蛋白在癌症病人的治疗中、地震、战争中抢救伤员具有重要的价值，特别针对老年免疫力低下患者具有重要作用。

是国家战略储备物资之一。

（2）白蛋白能够作为药物制剂的辅料，如疫苗佐剂、保护剂、稳定剂、赋形剂等，如狂犬疫苗、乙肝疫苗、白介素、激素、生长因子等重组蛋白质类药品。

美国FDA批准Idelvion［凝血因子IX（重组体）、白蛋白融合蛋白］用于儿童及成年血友病B患者。

Idelvion是获得批准的首款凝血因子- 白蛋白融合蛋白产品，也是为在血液中持续更长时间而在美国获得批准的第二款改进型因子IX 融合蛋白产品。

Idelvion 被用于替代因子IX，因子IX 是一种自然产生凝血因子，血友病B （也称先天性凝血因子IX 缺乏或克雷司马斯病）患者这种凝血因子缺失（功能性缺陷）或有缺陷。

Idelvion 由重组体DNA 技术将因子IX 与白蛋白连接而成，白蛋白是血液中发现的一种蛋白，当静脉注射使用时，白蛋白可使该产品持续更久。

注释：药用辅料（pharmaceutic adjuvant）是指生产药品和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，包含在药物制剂中的物质，是除原料药以外药物制剂不可缺少的组成部分。

辅料在药物制剂中可以充当载体，有利于制剂形态的形成，还具有增加药物稳定性、改变药物在体内的吸收、增加生物利用度、控制药物释放速度及释放部位、增加可接受性等作用。

药用辅料在不同的国家、地区使用情况有很大差别，欧盟有3000种，美国有1500种，我国有543种，在我国符合药用质量标准的辅料只占少数，《中国药典》二部（2010版）仅收载药用辅料132种。

由于药用辅料的用量较大，其质量直接影响和制约终产品的稳定性、安全性及有效性，因此，合理应用及开发研制新型辅料将对提高药物制剂的质量具有重要意义。

人血白蛋白是一种亲水性的物质，化学性能稳定，无免疫原性，生物兼容性好，在体内，分子链中的肽键可被酶降解为小分子而被吸收，因而是一种非常理想的药物载体，可作为抗肿瘤药物的载体而显著提高肿瘤细胞中药物的分布，提高药物靶向性。

此外，白蛋白还具有其他作用：与肽类药物融合可延长肽类药物的半衰期，减少用药剂量和药物副作用，减少患者用药次数；用于滴眼液治疗干眼症，能提高黏蛋白的分泌量；与胶原蛋白结合制成止血材料，不仅能结合、运输药物，还使止血材料增加了修复组织功能的作用；与聚乙二醇制成水凝胶，可用于外科手术中；与粒细胞集落刺激因子形成融合蛋白，可大大延长其半衰期等。

重组人血白蛋白与血源人血白蛋白具有相同的氨基酸组成及结构特征，其作用功能完全一致。

重组人血白蛋白的替代试验表明，在细胞培养、药用辅料及临床应用等方面与血源人血白蛋白完全相同，由于其比血源人血白蛋白纯度高，质量稳定，在安全性方面还优于血源人血白蛋白。

重组人血白蛋白替代血源人血白蛋白用于药物的研发和生产，尤其是用于药用辅料，不仅有助于彻底摆脱血液制品安全风险高、供应紧张的局面，更方便药政部门的监管；而其利用基因工程技术生产，工艺稳定，参数可控，批间均一稳定，也便于生产企业控制工艺条件，提升产品质量及市场竞争力。

（3）白蛋白能够结合脂肪酸、半胱氨酸、谷胱苷肽、胆红素、磷酸吡哆醛等，使它们避免被氧化。

同时白蛋白还能与铜离子螯合，阻止它参与氧化反应，所以白蛋白作为细胞培养基的有效成分能够促进细胞的生长，维持细胞膜的稳定性。

注释：•目前各大疫苗生产厂商面对市场需求纷纷扩产，将大大增加对培养基级白蛋白的需求量。

还有许多生物药的生产过程和最终产品中都需要白蛋白做保护剂。

作为培养基成分使用的人血白蛋白市场还将进一步扩大，发展潜力十分巨大。

近两年原料血浆供应减少，为保证危重病人用药的前提下，疫苗生产企业白蛋白的来源更加困难，特别是狂犬疫苗生产企业，白蛋白用量较大，前期病毒培养阶段需要用白蛋白，后加入白蛋白作为药用辅料，但是因为白蛋白供应减少，疫苗生产企业也面临生产瓶颈。

据我们此次调研得知，基于重组人血白蛋白的安全性、质量可控性、供货持续稳定性、以及大包装有效减少疫苗生产过程二次污染，下游疫苗企业对于人血白蛋白品种的更换态度积极；另外，由于人血白蛋白目前的供不应求的状态，SFDA 一方面严把质量安全关，另一方面也将积极进行下游疫苗生产企业生产工艺变更的审批。

‚研究表明，接种疫苗后出现的过敏反应绝大多数与动物源性明胶相关，发生过敏反应的儿童血清中80%以上均可检测出抗明胶IgE。

水解明胶来源于动物组织，水解后产物为动物源多肽混合物，相对分子质量、等电点等理化性质均不明确，纯度及污染控制等问题难以解决。

另外，来源于牛或猪的动物源性明胶具有携带动物源性病毒的潜在危险性，病毒侵入可能引起人的海绵体脑炎等传染性疾病。

（4）人血清白蛋白作为化妆品原料，其功能是修复皮肤损伤、抗衰老、保湿、增白等功效。