腺病毒载体构建PPT课件

•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
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腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
重组腺病毒的构建
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腺病毒
•腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米 的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252个。 核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感染的细 胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
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腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒
构成：一、包含全
部（或右侧大部分）
腺病毒基因组DNA
的大质粒，即骨架
质粒
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二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）wenku.baidu.com
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AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染性 强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
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腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表达，. 整合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
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包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
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腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）