分子病毒学病毒载体优秀课件
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分子病毒学 8病毒载体
• Virus are obligate intracellular parasites • Very efficient at transferring viral DNA into
host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
4
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
4
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
分子病毒学病毒载体优秀课件
• Advantages
– High titers – Both dividing and non-dividing cells – Wide tissue tropism – Easily modify tissue tropism
• Disadvantages
– Transient expression ( not good for genetic diseases) – Highly immunogenic – High titers of virus can be toxic – More suitable for cancer immunotherapy
(AAV)
• Integrating / Concatameric •Long Term Expression
• Complex Production &
Purification
•Multi pDNA &/or Helper
Virus
•Lower Titre Than
Adenovirus
• Serotype Differences In
• Advantages
– Integration and persistent expression – No insertional mutagenesis – Infecting dividing and nondividing cells – Safe
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
•.
•23
•.
•24
Characteristics of retroviral vector
– High titers – Both dividing and non-dividing cells – Wide tissue tropism – Easily modify tissue tropism
• Disadvantages
– Transient expression ( not good for genetic diseases) – Highly immunogenic – High titers of virus can be toxic – More suitable for cancer immunotherapy
(AAV)
• Integrating / Concatameric •Long Term Expression
• Complex Production &
Purification
•Multi pDNA &/or Helper
Virus
•Lower Titre Than
Adenovirus
• Serotype Differences In
• Advantages
– Integration and persistent expression – No insertional mutagenesis – Infecting dividing and nondividing cells – Safe
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
•.
•23
•.
•24
Characteristics of retroviral vector
分子病毒学_8病毒载体
Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
Modification of the tropism of adenovirus vector
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
病毒载体概述ppt课件
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
7
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
12பைடு நூலகம்
重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
实验室
细胞培养 培养瓶 细胞裂解 反复冻融 病毒分离 离心
病毒纯化 密度梯度超速离心
制剂
缓冲液
保存
低温
大量制备和纯化
中试车间 转瓶、细胞工厂、发酵罐 机械法或化学法裂解 离心、超滤、萃取 浓缩、柱层析 配方
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
7
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
12பைடு நூலகம்
重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
实验室
细胞培养 培养瓶 细胞裂解 反复冻融 病毒分离 离心
病毒纯化 密度梯度超速离心
制剂
缓冲液
保存
低温
大量制备和纯化
中试车间 转瓶、细胞工厂、发酵罐 机械法或化学法裂解 离心、超滤、萃取 浓缩、柱层析 配方
《分子生物学载体》课件
03
基因敲除与基因沉默的意义
用于研究基因功能、治疗遗传性疾病和癌症等疾病，具有重要的科学和
医学价值。
基因治疗与基因疫苗
1 2 3
基因治疗
利用分子生物学载体将正常基因导入到病变细胞 中，替代或修复缺陷基因，实现治疗疾病的目的 。
基因疫苗
利用分子生物学载体将抗原基因导入到受体细胞 中，表达出具有免疫原性的蛋白质，用于预防和 治疗疾病。
详细描述
病毒载体通常由病毒的基因组DNA或RNA以及外源基因的插入位点组成。通过 将病毒载体导入宿主细胞，可以实现外源基因的高效转移和表达。病毒载体在基 因治疗和疫苗开发等领域具有广泛应用。
人工染色体载体
总结词
人工染色体载体是一种人造的染色体，用于克隆和表达大片段DNA。
详细描述
人工染色体载体通过人工构建的方式模拟天然染色体的结构和功能，可以容纳大片段的外源DNA。人 工染色体载体具有稳定遗传、高容量等特点，适用于克隆和表达大型基因组片段以及功能基因组学研 究。
02
常用分子生物学载体介绍
质粒载体
总结词
质粒载体是一种小型环状DNA分子，常用于基因克隆和表达 。
详细描述
质粒载体具有自我复制能力，可以在宿主细胞内独立于染色 体进行复制，并且可以稳定遗传。质粒载体通常包含多个限 制性酶切位点，用于插入外源DNA片段，同时还有选择标记 基因，用于筛选含有目的基因的克隆。
风险评估与控制
进行全面的风险评估，采取必要的措施控制潜在的风险。
知情同意
确保受试者充分知情并自愿参与研究，签署知情同意书。
隐私保护
采取措施保护受试者的隐私和个人信息，防止泄露。
THANKS
感谢观看
生物制药
病毒载体PPT课件
33
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
32
第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
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第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
2024版《病毒》PPT精品课件
《病毒》PPT精品课件•病毒基本概念与特性•常见病毒类型及其危害•防护措施与策略部署目•杀毒软件原理及使用技巧•总结回顾与未来展望录病毒基本概念与特性01病毒是一种非细胞形态的生物体，依赖宿主细胞进行复制和生存。
起源理论包括细胞起源、共进化等，目前尚无定论。
病毒与生物圈的关系密切，对生物进化有重要影响。
病毒定义及起源病毒结构与分类病毒结构包括核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳，部分病毒还有脂质包膜。
根据核酸类型，病毒可分为DNA病毒和RNA病毒。
根据感染对象，病毒可分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒（噬菌体）。
组装与释放新合成的病毒核酸和蛋白质在宿主细胞内组装成完整病毒粒子，然后释放到细胞外。
利用宿主细胞原料和酶系统，合成病毒核酸和蛋白质。
脱壳病毒蛋白外壳在宿主细胞内解体，释放核酸。
吸附病毒通过特定部位与宿主细胞结合。
注入病毒核酸进入宿主细胞。
病毒复制周期传播途径包括直接接触传播、飞沫传播、空气传播、水传播、食物传播等。
不同病毒的传播途径和宿主范围各异，了解其特性有助于防控病毒感染。
病毒宿主范围指病毒能感染的细胞类型或生物种类。
病毒宿主范围与传播途径常见病毒类型及其危02害通过计算机网络传播，占用系统资源，导致计算机运行缓慢或崩溃。
蠕虫病毒木马病毒宏病毒隐藏在看似正常的程序中，窃取用户隐私信息，如账号密码、信用卡信息等。
感染Office 等办公软件的宏命令，通过文档传播，破坏数据文件和系统文件。
030201计算机病毒伪装成正常应用，窃取用户隐私信息、恶意扣费、控制手机等。
恶意APP在手机屏幕上弹出大量广告，干扰用户正常使用手机。
广告软件通过蓝牙、Wi-Fi 等无线方式传播，占用手机资源，导致手机运行缓慢或崩溃。
蠕虫病毒手机病毒网络蠕虫和僵尸网络网络蠕虫利用漏洞在计算机网络中传播，占用网络资源，导致网络拥堵或瘫痪。
僵尸网络由被黑客控制的计算机组成，用于发动网络攻击、散播垃圾邮件等恶意行为。
勒索软件与恶意广告勒索软件通过加密用户文件或锁定计算机屏幕，要求用户支付赎金以解锁或恢复数据。
《分子生物学载体》PPT课件
48
2.3.2 M13 噬菌体
寄主：大肠杆菌。 DNA长度：6407 bp。 外型: 丝状 组成: 由外壳包装蛋白和正链DNA组成 基因: 至少有10个基因
DNA提纯：RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝 形式存在。 成熟的噬菌体里只包装有 +DNA， 也容易提取。
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5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖
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异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
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2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 • 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一类细 菌病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞， 然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组 中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种 状态还会相互转化。
精选ppt
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• 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和 多酶接头polylinker
• 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异 序列，便于外源基因的整合。
• 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制 子，便于基因能在两种不同的受体细胞中 复制。
• 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件。
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如何阅读质粒图谱
物。
（2）低拷贝数的质粒载体 不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途。
（3）温控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
温度低（低于37 ℃），拷贝数很少； 温度增加（>40 ℃）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
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Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
(L1-L5)
• Causes a benign respiratory infections in human • Serotypes 2 and 5 are commonly used as vectors
• Virus are obligate intracellular parasites • Very efficient at transferring viral DNA into
host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
• Modify the fiber protein
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Characteristics of adenoviral vector
viral vector
韩晓
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1
Methods of gene delivery
• Viral Vectors:
– Adenovirus – Retrovirus – Lentivirus – Adeno-associated virus (AAV) – Herpes simplex virus (HSV)
• Non-viral vector based
– Naked DNA (plasmid DNA): injection or genegun – Liposomes (cationic lipids): mix with genes
• Ex-vivo • In vivo
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2
Why use viral vectors
herpesvirus) for replication (dependovirus)
• AAV-2 mostly used for vector
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5
Adeno-Associated Virus
• Single Stranded DNA Virus
–Viral ITRs & Rep / Cap –~ 5kb Capacity
(AAV)
• Integrating / Concatameric
–Long Term Expression
• Complex Production &
Purification –Multi pDNA &/or Helper Virus –Lower Titre Than Adenovirus
• Serotype Differences In
• Advantages
– Integration and persistent expression – No insertional mutagenesis – Infecting dividing and nondividing cells – Safe
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins
– Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
• Gene replacement: non-essential genes of
virus are deleted and exogenous genes are inserted
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3
Generation of viral vector for gene therapy
• Replication-competent virus • Replication-defective virus
Receptors
–AAV2 Heparan Sulphate
–AAV5 Sialic Acid
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6
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7
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8
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9
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10
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11
Generation of adeno-associated virus vector.Βιβλιοθήκη 12.13.
14
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15
Characteristics of AAV vector
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Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
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Early generations of adenoviral vector (replication defective)
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Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
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Modification of the tropism of adenovirus vector
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence