分子病毒学 8病毒载体
病毒载体是什么？
病毒载体是什么？
质粒与噬菌体都有严格的宿主选择性，只能在相应的菌体中生存和繁殖，所以它们远不能完成载体在基因工程中所承担的全部使命。
动物细胞没有质粒，如果要向动物细胞导入外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。
病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，掠夺细胞的“生物合成机器”生产它自己的DNA、RNA和蛋白质，因此它是功能强大的基因转移载体。
动物病毒载体，如腺病毒载体、杆状病毒载体等，是比较理想的真核基因工程载体。
虽然对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟，但它们具有潜在的应用前景。
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入体系（gene delivery system）是基因治疗的焦点技巧,可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.本章重要阐述用于人类基因治疗的病毒载体系统.用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本前提：1.携带外源基因并能包装成病毒颗粒;2.介导外源基因的转移和表达;3.对机体不致病.然而,大多半野生型病毒对机体都具有致病性.是以须要对其进行改革后才干用于人体.原则上,各类类型的病毒都能被改革成病毒载体.但是因为病毒的多样性及与机体庞杂的依存关系,人们至今对很多病毒的生涯周期.分子生物学.与疾病产生及成长的关系等的熟悉还很不周全,从而限制了很多病毒成长成为具有实用性的载体.近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒（包含HIV病毒）.腺病毒.腺病毒陪同病毒.疱疹病毒（包含单纯疱疹病毒.痘苗病毒及EB病毒）.甲病毒等被成功地改革成为基因转移载体并开展了不合程度的运用.第一节病毒载体产生的道理病毒载体的产生树立在对病毒的生涯周期和分子生物学熟悉的基本之上.研讨病毒载体起首要对病毒的基因组构造和功效有充分的懂得,最好能获得病毒基因组全序列信息.病毒基因组可分为编码区和非编码区.编码区基因产生病毒的构造蛋白和非构造蛋白;根据其对病毒沾染性复制的影响,又可分为必须基因和非必须基因.非编码区中含有病毒进行复制和包装等功效所必须的顺式感化元件.各类野生型病毒颗粒都具有必定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有必定的限制.一般来说,病毒包装容量不超出自身基因组大小的105～110％.基因重组技巧的成长使病毒载体的产生成为可能.最简略的做法是,将恰当长度的外源DNA拔出病毒基因组的非必须区,包装成重组病毒颗粒.比方,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）拔出HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不转变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等,1998）.因为UL44基因产品对于HSV病毒在造就细胞中产毒性沾染长短必须的,是以,该重组病毒可以在细胞中增殖传代.用这种重组病毒沾染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达.用同样的办法,将AAV-2病毒的rep和cap基因片断（4.3kb）拔出HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中,构建成具有供给重组AAV载体复制和包装所需的全体帮助功效的帮助病毒rHSV-rc（伍志坚等,1999）.然而,如许的重组病毒作为基因转移载体有很多缺点.起首,很多野生型病毒经由过程在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解逝世亡;或带有病毒癌基因而使细胞产生转化.是以必须经由改革使其成为复制缺点性病毒并且删除致癌基因后才干用于基因治疗.其次,拔出外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒陪同病毒（AAV,4.7kb）.反转录病毒（8～10kb）.腺病毒（36kb）,假如不去除病毒基因,可供外源DNA拔出的容量就十分小.是以,必须删除更多的病毒基因以腾出地位拔出较大的外源DNA. 为了增长病毒载体拔出外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必须基因外,还可以进一步删去部分或全体必须基因,这些必须基因的功效由帮助病毒或包装细胞系反式供给.病毒载体大体上可分为两种类型：重组型病毒载体：这类载体是以完全的病毒基因组为改革对象.一般的步调是选择性地删除病毒的某些必须基因尤其是立早基因或早期基因,或掌握其表达;缺掉的必须基因的功效由互补细胞反式供给;用外源基因表达单位替代病毒非必须基因区;病毒复制和包装所需的顺式感化元件不变.这类载体一般经由过程同源重组办法将外源基因表达单位拔出病毒基因组中.如在传统的重组腺病毒构建办法中,将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）拔出穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中,与帮助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞,通细致胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）.无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不合的病毒载体系统中的称谓不合.对于腺病毒,一般称为mini-Ad;在HSV载体系统,一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体.重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体.这类载体系统往往由载体质粒和帮助体系构成.重组载体质粒重要由外源基因表达盒.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件及质粒骨架构成.帮助体系包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.在帮助体系的感化下,重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定情势（单链或双链,DNA第二节病毒载体的包装体系将外源基因包装到病毒壳粒中,是病毒载体临盆的焦点技巧.一般地,病毒载体的制备包含以下要素：宿主细胞固然如今已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al . 1998; Ding L et al. 1997）,但是这种包装体系仍然须要细胞提取物,并且包装效力相当低,远远达不到可临盆程度.至今为止,病毒载体的包装主如果在对该病毒迟钝的宿主细胞中进行的.宿主细胞不单供给了病毒复制和包装的情形前提,很多细胞成分还直接介入了病毒复制和包装的进程.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒一般地,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒由细菌质粒携带,构成病毒载体质粒,是被包装的对象.因为病毒复制方法的不合,有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时,全部载体质粒都被包装进入病毒颗粒中;而有些病毒载体如反转录病毒.腺病毒陪同病毒载体的质粒骨架部分其实不被包装到病毒颗粒中,只有病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中.构建重组型病毒载体时,病毒复制和包装所需的顺式感化元件消失于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有沾染性的病毒颗粒供给,也可以质粒情势供给）.先将外源基因表达盒拔出穿梭质粒携带的病毒同源序列中;将重组穿梭质粒转染至细胞中,再用帮助病毒超沾染;或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞;重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因的重组病毒. 重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）和重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al. 1997;Kramm CM et al. 1997）的传统制备办法都是采取这种方法.为了使病毒载体的临盆更为便利,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外,也可以用另一种病毒（往往是帮助病毒）或临盆细胞来携带.帮助元件包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.这些元件一般包含病毒基因转录调控基因.病毒DNA合成和包装所需的各类酶类的基因.病毒的外壳蛋白基因等.帮助元件的表示情势可以多种多样.经常运用的情势有：①帮助质粒（helper plasmid）,如用于产生重组腺病毒的质粒JM17,用于重组AAV包装的帮助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等;②帮助病毒（helper virus）,如用于HSV 扩增子载体包装的帮助病毒HSV1 tsK株;③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞.这些表示情势之间可以互相转化或归并.例如,帮助病毒可以转化为帮助质粒：传统的AAV载体临盆体系经常运用腺病毒作为帮助病毒.研讨发明,并不是腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必须的,只须要腺病毒E1a,E1b, E2a, E4和VA RNA 5种基因就行了.是以,将这5种基因置于同一个质粒中,构建成的这种新的帮助质粒就完全可以替代本来的帮助病毒（Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998 ）,不单进步了包装效力,并且防止了产品中腺病毒污染的问题.上述几种要素的不合组合,便产生了各类各样的病毒载体包装计谋.根据病毒载体临盆体系的构成身分的若干,可将其分成以下几种：单构成身分临盆体系（one-component system）：所有的构成成分都分散在临盆细胞中.经典的反转录病毒临盆体系就是由产病毒细胞（VPC）构成,重组反转录病毒由VPC细胞不竭排泄至造就上清中.这种临盆体系操纵最为简略,但是往往产量不高或不稳固.采取这种计谋,须要将重组病毒产生所须要的所有元件都稳固地置于临盆细胞中.因为很多病毒基因产品本身对细胞有损坏感化或不克不及在细胞中稳固表达,是以这种计谋在很多病毒载体的临盆中难以实行.双构成身分临盆体系（two-component system）这种临盆系同一般由"一株病毒/一株细胞"构成.典范的例子是重组腺病毒临盆体系.先用共转染的办法获得重组腺病毒毒种,再由该毒种和临盆细胞（如293细胞）构成一个双构成身分的临盆体系使病毒大量扩增.多构成身分临盆体系（multi-component system）是由两种以上的构成身分构成的临盆体系.传统的AAV载体临盆体系就是由载体质粒,帮助质粒,帮助病毒和临盆细胞4种身分构成.这种计谋的缺点是影响身分多,操纵庞杂,产量不轻易稳固,晦气于大范围临盆. 以上各类临盆体系也可以互相转化.我们实验室经由过程将上述AAV载体临盆体系的4种身分进行两两归并,即将帮助质粒和帮助病毒归并成一种重组的帮助病毒,将载体质粒和临盆细胞归并成AAV前病毒细胞株,成功地将其转化成一种双构成身分的新型高效临盆体系（伍志坚等,1999）.一般来说,成长新的包装计谋主如果为了以下几种目标：（1）削减临盆体系中的构成身分,简化操纵进程;（2）进步临盆效力,下降临盆成本;（3）防止或下降野生型病毒的产生;（4）防止运用难以与产品病毒分别的帮助病毒.第三节病毒载体的纯化办法重组病毒的纯化与基因工程产品的纯化既有很多共性,又有明显的不合之处.病毒可以看作是一个具有特定构造的生物大分子,一般都由位于中间的核酸和包裹于其外的蛋白外壳构成.有些病毒还具有脂质膜和糖蛋白或糖脂.很多分别纯化蛋白质的办法如离心和梯度离心.盐析.柱层析.超滤.透析等办法都可用于病毒的纯化.然而,因为病毒构造的庞杂性,纯化时不克不及采取蛋白质变性和复性的办法,因为一旦病毒蛋鹤产生变性,或病毒构造产生损坏,在体外就很难再重建成有沾染性的病毒颗粒.是以,在病毒的纯化进程中必须保持病毒的构造不受损坏,并且监测其沾染活性.病毒的纯化一般分为以下几个步调：初始物（start material）的收集或制备根据病毒产生方法的不合而采纳不合的方法.对于不导致细胞病变和逝世亡的病毒如反转录病毒,可不竭收集产毒细胞（VPC细胞）的造就上清作为初始物;对于在临盆病毒进程中宿主细胞产生病变和逝世亡的病毒如腺病毒,在病毒产生达到岑岭时,收集造就上清,并裂解细胞以释放细胞内的病毒.造就上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物.在实验室的小范围制备中,往往采取将造就上清与细胞一路反复冻融3～4次的办法制备细胞裂解液作为初始物.对于初始物体积大于500ml的较大范围的制备,则须要斟酌采取不合初始物的损益率.假如收集时大部分（90％以上）目标病毒仍消失于细胞中,为了削减操纵大体积初始物带来的便利,可以斟酌废弃上清中含有的目标病毒,而经由过程低速离心收集细胞,重悬于较小体积的缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液.对于腺病毒和AAV病毒的大范围制备都可以采取这种方法.假如经由过程延伸造就时光可以使大部分的目标病毒释放到造就液中,也可以只收集造就上清而弃去细胞,从而省去反复冻融的步调.除了用反复冻融办法裂解细胞外,还可以根据目标病毒的生物学性质采取其它不影响其沾染性的办法,如超声法.化学法（如在AAV病毒制备顶用脱氧胆酸或氯仿）等.初始物的浓缩当初始物体积较大时,要斟酌对其进行浓缩后再分别纯化.浓缩时最好同时能获得初步纯化对于后果. 在不影响目标病毒的沾染性的前提下,可选用盐析.超滤.透析等办法进行浓缩.盐析法不但可以用来浓缩初始物,同时也能达到必定的分别纯化后果.最经常运用的盐是硫酸铵;很多病毒如腺病毒.AAV病毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠体系沉淀可获得很好的后果并且不影响病毒的沾染性.目标病毒的分别纯化氯化铯密度梯度离心法至今仍是分别纯化各类病毒的最经常运用办法.主如果根据不合病毒具有特点性的浮力密度,使其与细胞裂解液中的其它成分分别开来.收集到目标病毒特异的组分后,用透析法除去个中的氯化铯,获得纯化的病毒.用这种办法有时可获得极高纯度的病毒.今朝在临床实验中运用的重组腺病毒大都是用这种办法进行纯化的.然而,这种办法也消失明显的弊病,主如果费时且操纵难度较大,反复性较差;并且氯化铯对人体有毒性.是以跟着基因治疗研讨和运用的成长,用这种办法纯化的重组病毒可能不克不及顺应人体内运用的请求.第五节安然性检测总的来说,病毒载体系体例剂的安然性检测重要涉及以下几个方面（Aderson RW 1996）：有复制才能的病毒（replication competent virus, RCV）RCV一般产生于重组病毒临盆进程中基因重组事宜.因为RCV具有复制才能,在临盆进程中一旦消失,就可能呈现优势发展,从而影响载体病毒的产量;别的,含有RCV的成品用于人体内可能导致轻微的病毒沾染或急性/慢性病毒血症.RCV是对用于基因治疗的病毒载体系体例剂安然性检测的特有项目.检测RCV的办法因不合的病毒载体而异.对于反转录病毒载体,检测有复制才能的反转录病毒（RCR）的办法主如果PG4 S+L- 剖析法;也可采取其它的变通办法.对于腺病毒载体,检测有复制才能的腺病毒（RCA）重要采取空斑剖析办法及PCR办法.帮助病毒对于临盆进程须要帮助病毒介入的病毒载体如AAV病毒载体,因为这些帮助病毒本身具有复制才能并对机体细胞有损坏性,是以检测病毒制剂中的帮助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒的残存量十分重要.其它成分的污染检测指标包含细菌.霉菌.支原体.内毒素等及在纯化进程中所用试剂如氯化铯等的残存量.第六节病毒载体的成长偏向基因治疗研讨的快速成长对基因导入体系提出了越来越高的请求.病毒载体的成长也日新月异,包含对已有病毒载体的不竭改良和完美,和越来越多的其它病毒被改革成为新的病毒载体.病毒载体的成长偏向可归纳成以下几个方面：轻便.高效的病毒载体包装体系：斟酌到包装的高效性和操纵的轻便性,越来越多的病毒载体临盆体系将采取双构成身分体系.这种体系轻易用于病毒载体的大范围临盆（Liu XL et al.1999; Conway JE et al. 1999 ）.无病毒基因的病毒载体（gutless viral vector）：去除病毒载体中所有的病毒基因,只保存其复制和包装所必须的顺式感化元件,是病毒载体的重要成长偏向.这种计谋可最大限度地扩展载体的容量和削减病毒对细胞的直接毒性和病毒蛋白表达引起的免疫毒性. 腺病毒的微载体（mini-Ad）.AAV载体.HSV扩增子载体都是无病毒基因的病毒载体.这一成长偏向须要解决的重要问题是树立高效.安然（无帮助病毒污染）的包装体系.可调控表达外源基因的病毒载体：在很多疾病的基因治疗中,实现外源基因的可调控表达十分重要.如糖尿病的基因治疗,外源的胰岛素基因的表达最好能受血糖程度的调控;肾性贫血的基因治疗,EPO基因的表达最好能受血氧含量的调控等.今朝所研讨的表达调控体系重要包含各类药物引诱的表达"开关".个中四环素掌握体系（Tet-on和Tet-off）是人工设计的一种基因表达调控模式.这个体系在体外和动物体内实验中都表示出优越的表达调控感化（Fotaki ME et al.1997; Miller N and Whelan J 1997）.然而,因为个中的反式感化蛋白（tTA或rtTA）是异种蛋白,在机体内可能引起毒性感化和免疫反响,是以用于人体前还需斟酌其安然性和长期有用性.比来Binley K等（1999）报导了用缺氧反响元件（hypoxia response element ,HRE）腺病毒载体中外源基因的表达.缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子的表达,它们可结合HRE焦点序列上,诱发其下流基因的表达.自我扩增型载体（self-amplifying vector）（Herweijer H and Wolff JA 1997）：今朝的基因转移办法基因转移的效力仍相对较低,尤其是在体内.为了进步外源基因表达总程度,除了进步基因转移效力外,另一种办法是尽量进步外源DNA在细胞中的表达程度.用自我扩增型的表达载体是达到此目标的办法之一.这些载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和Semliki Forest 病毒为基本的.用目标基因代替病毒的外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组,mRNA程度的大量增长导致高程度的转导基因表达.自我扩增型载体的表示情势可所以RNA,DNA和重组病毒.特异性复制型性病毒载体（specifically replicating vector）：指可在某种特点的组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖的病毒载体.这类病毒载体重要用于特异性裂解肿瘤细胞.如腺病毒突变株Onyx-015是55KdalE1B基因功效缺掉的腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖.用这种突变株结合化疗治疗恶性肿瘤II 期临床成果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998）,已进入III期临床实验,从此,很多人工改革的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研讨中.如将腺病毒E1基因的表达用甲胎蛋白（AFP）启动子掌握,使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中增殖导致细胞逝世亡.也可以将这种病毒的基因组分开装在两个互补的缺点性腺病毒载体上（Alemany R et al. 1999）,个中一个载体除了腺病毒复制和包装所必须的顺式感化元件外,只含有E1区基因,个中E1A基因的表达受AFP启动子的掌握;另一个载体为E1区缺掉的重组腺病毒.这两个载体同时沾染AFP阳性的肝癌细胞时,病毒可不竭增殖而引起细胞逝世亡;对于AFP阴性的细胞,E1A基因不表达,因而病毒不克不及增殖.相似的设计在HSV载体系统也有报导.除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外,各类其它组织特异性表达的蛋白和调控序列都可被用来掌握病毒的增殖.嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：是指将不合病毒的基因元件进行组合,形成的重组杂合病毒.如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒,既具有腺病毒的沾染性和基因组特点（双链线状DNA）,又具有AAV病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）.各类病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报导层见叠出,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）.腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等,不一而足.这些杂合载体使重组病毒的特点多样化,以顺应不合基因转移目标的须要.靶向性病毒载体（targeted viral vector）：是指能特异性地结归并沾染某种细胞的病毒载体.靶向性病毒载体的产生重要有两种办法.一种办法是将病毒颗粒与某一靶向分子（Harari OA et al.1999 ）或特异性抗体（Bartlett JS et al. 1999）偶联;另一种办法是经由过程转变病毒外壳蛋白的构造,使其对细胞的亲嗜性产生转变（Reynolds P et al.1999;Krasnykh VN et al. 1996 ）.用各类其它病毒构成新型病毒载体：略.参考文献Aderson RW. 1996. Forum'96: Gene Therapy. P21-24Alemany R, Lai S, Lou YC et al. 1999. Complementary adenoviral vectors for oncolysis. Cancer Gene Ther. 6:21-25Bartlett JS, Kleinschmidt J, Boucher RC et al. 1999. Targeted adeno-associated virus vector transduction of nonpermissive cells mediated by bispecific F(ab'γ)2 antibody. Nature Biotechnology. 17:181-186Caplen NJ, Higginbotham JN, Scheel JR, Vahanian N et al. 1999Adeno-retroviral chimeric viruses as in vivo transducing agents. Gene Ther. 6:454-459Conway JE, Rhys CMJ, Zolotuklin I et al. 1999. High-titer recombinant adeno-associated virus production utilizing a recombinant herpes simplex virus type I vector expressing AAV-2 rep and cap. Gene Ther. 6:986-993 Ding L, Lu S and Munshi NC. 1997. In vitro packaging of an infectious recombinant adeno-associated virus 2. Gene Ther. 4:1167-1172Fotaki ME,Pink JR, Mous J 1997. Tetracycline-responsive gene expression in mouse brain after amplicon-mediated gene transfer. 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Insertion of an RGD motif into the HI loop of adenovirus fiber protein alters thedistribution of transgene expression of the systemically administered vector.Rolling F and Samulski J. 1995 AAV as a viral vector for human gene therapy. Molecular Biotechnology. 3:9-15Summerford C and Samulski J. 1999 Viral receptors and vector purification : new approaches for generating clinical-grade reagents. Nature Med. 5:587-588Tan BT, Wu L, Berk AJ. 1999. An adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid vector that stably transforms cultured cells with high efficiency. J Virol . 73: 7582-7589Xiao X, Li J, Samulski J. 1998. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72:2224-2232Zhou XH and Nicholas Muzyzca. 1998. In vitro packaging of adeno-associated virus DNA. J Virol. 72:3241-3247.伍志坚,吴小兵,侯云德. 1999. 具有AAV载体包装功效的重组HSV的产生. 科学传递. 44（5）：506-509吴小兵,董小岩,伍志坚等. 1998. 以粘粒为基本产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研讨. 病毒学报. 14:359-364。
病毒载体-2014-10
Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV)
• amphotrophic virus • The essential regions include the 5' & 3' LTRs & the packaging sequence lying downstream of the 5' LTR. • Transgene expression can either be driven by the promoter/enhancer region in the 5' LTR, or by alternative viral (e.g. cytomegalovirus, Rous sarcoma virus) or cellular (e.g. beta actin, tyrosine) promoters
优点
• Broad range of infectivity and high titer • Infection does not require an actively dividing host cell • Expressed human proteins are properly folded and modified • Large insert size • AdEasy vector is non-insertional
• selectable markers, such as neomycin & beta galactosidase, can be included • The available carrying capacity for retroviral vectors is approximately 7.5 kb • Altering the env gene or its product has proved a successful means of manipulating the cell range
病毒分子生物学
1、腺病毒
1953年，Rowe等人从外科手术摘除的儿童腺体中分离到一种致病因子， 可以使培养的细胞发生慢性进行性病变，称之为腺体退化因子，后来证明这 种致病因子是病毒，1956年，Enders等建议命名为腺病毒。
腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、鸟类和两栖类动物中都已
分离到。 腺病毒能引起呼吸系统，消化系统，泌尿系统等多个系统的感染。腺病 毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致使 细胞的功能失常。 患者和隐性感染者是腺病毒感染的主要传染源，主要通过呼吸道飞沫近 距离传播，在相对密闭，通风不畅的场所容易发生传播。
病毒分子生物学
目 录
病毒分子生物学研究的内容
DNA病毒的分子生物学
RNA病毒的分子生物学
一、病毒分子生物学研究的内容
1.1 病毒基因组的结构
不同类型的病毒，其基因组有很大差异。在核酸类型上，有DNA病毒(如 腺病毒)，有RNA病毒(如HIV病毒)，但对每一种病毒来说，它只能含有一种 核酸。 从核酸结构上看，有的是单链核酸，有的是双链核酸，有的是线状，有 的是环状。 相对于能独立生活的微生物来说，病毒的基因组非常简单。完整的病毒 颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA。外壳蛋白（或被膜）的功能
1.5 病毒基因工程疫苗与病毒载体
基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表达病原微生物的一段基因序列， 将表达产物(多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性)用作疫苗， 例如正在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。 常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽疫苗两类。以流感疫苗为例，其 途径就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出来，再制备 cDNA，克隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。 由于基因工程疫苗具有安全性好、产量高、成本低，以及良好的免疫原
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入系统（gene delivery system ）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105〜110 %。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将 4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA ）插入HSV1病毒的UL44 （糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100 （吴小兵等，1998 ）。
【大四 必修】分子生物学第十五章 病毒的分子生物学教案
第十五章病毒的分子生物学第一节、研究内容概念：分子病毒学是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构和功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用等进行研究的一门学科。
主要内容如下：一、病毒基因组的结构与功能核酸类型： DNA病毒——腺病毒、乙型肝炎病毒等RNA病毒——反转录病毒、丙型肝炎病毒等核酸结构：单链、双链、线状、环状正链RNA单链负链RNA病毒核酸的分子量与细菌相比要小病毒基因组的结构与功能病毒基因组的复制和表达调控病毒对宿主细胞的影响病毒与肿瘤发生病毒基因工程疫苗及病毒载体二、病毒基因组的复制和表达调控１、释放到细胞外 ２、 表达：转录、翻译 （1） 正链RNA 病毒：直接作为模板,复制RNA同时共有mRNA 作用→翻译单一大分子肽链→修饰（蛋白酶降解）结构或非结构蛋白（2） 负链RNA 病毒：不能直接行使mRNA 功能→cRNA(互补RNA) →作为模板 必须自身携带依赖RNA 的RNA 聚合物 （3） 反转录病毒：正单链RNA 、以双体形式存在 含有依赖RNA 的DNA 聚合酶双链DNA宿主细胞DNA 中 子代病毒核酸（4） D NA 病毒：大多数为双链DNA利用宿主细胞本身的转录酶来转录mRNA早期转录：病毒DNA 复制所需要的酶及调节蛋白调节蛋白 抑制宿主细胞核酸转录和翻译 调控早期或晚期基因的表达转录 整合复制晚期转录：病毒的衣壳蛋白或包膜糖蛋白 病毒翻译的部位：宿主细胞核糖体 所需的原料由宿主细胞提供三、病毒对宿主细胞的影响宿主细胞形态、结构的影响 宿主细胞功能1、病毒对细胞形态、结构的影响（1）在受体细胞表面表达病毒基因编码的糖蛋白→宿主细胞之间发生融合→巨核合胞体（2）肿瘤相关病毒癌蛋白 宿主细胞抑癌基因失活激活细胞癌基因(3)引起细胞凋亡（Apoptosis ）：如HIV →CD 4死亡 2、病毒对宿主细胞功能的影响特点：①病毒感染细胞后：利用宿主细胞相应的系统完成自身的复制、转录和翻译②病毒早期产物： 抑制宿主细胞的转录促进病毒早、晚期基因的转录③降解细胞mRNA 或与宿主细胞竞争翻译系统来抑制宿主细胞mRNA 的进一步翻译→增加病毒mRNA 与核糖体亚基的结合效率表达 肿瘤宿主四、病毒与肿瘤发生 乙肝病毒→肝癌 EB 病毒→鼻咽癌 HIV →kaposi’s 肉瘤五、病毒基因工程疫苗及病毒载体基因工程疫苗的概念：利用基因工程的方法（基因重组），将病原微生物的一段基因序列（有较强的免疫原性、无致癌性）克隆在表达载体中，所表达的产物作为抗原，称之为疫苗。
分子病毒学_8病毒载体
Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
Modification of the tropism of adenovirus vector
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
分子病毒学
分子病毒学1. 简介分子病毒学是病毒学的一个分支，主要研究病毒的分子结构、遗传物质组成、复制机制以及与宿主细胞的相互作用等方面的内容。
通过研究病毒的分子机制，我们可以更好地理解病毒的生物学特性，并寻找新的抗病毒策略。
2. 病毒的基本结构病毒是一种非细胞性的微生物，它由一个蛋白质的外壳（衣壳或包膜）和包含遗传信息的核酸（DNA或RNA）组成。
根据病毒的外壳和遗传物质的性质，病毒可以被分为多种类型，包括单链RNA病毒、双链RNA病毒、单链DNA病毒和双链DNA病毒等。
病毒的外壳主要由蛋白质构成，这些蛋白质可以形成不同的结构，例如蛋白质的六角形晶格结构、蛋白质纤维结构等。
不同的病毒外壳结构决定了它们对宿主细胞的感染方式和复制机制。
3. 病毒的复制机制病毒依赖于宿主细胞进行复制，它们不能独立生存。
病毒的复制机制可以分为四个主要步骤：吸附、渗透、复制和释放。
首先，病毒需要与宿主细胞表面的受体结合，这个过程被称为吸附。
吸附是病毒感染的第一步，它决定了病毒是否能够进入宿主细胞。
接下来，病毒将其遗传物质注入宿主细胞内，这个过程被称为渗透。
在渗透过程中，病毒释放出其核酸，核酸与宿主细胞的细胞器相互作用，导致宿主细胞的基因表达被病毒控制。
然后，病毒利用宿主细胞的生物合成机制进行复制。
它利用宿主细胞的酶和蛋白质合成机制合成新的病毒颗粒，最后将其装配成熟的病毒。
最后，病毒将新合成的病毒颗粒释放到环境中，这个过程被称为释放。
释放后，病毒可以感染更多的宿主细胞，以完成其生命周期。
4. 病毒与宿主细胞的相互作用病毒与宿主细胞之间存在复杂的相互作用关系。
病毒通过与宿主细胞表面的受体结合，进入宿主细胞；利用宿主细胞的生物合成机制进行复制；并通过改变宿主细胞的基因表达，控制和操纵宿主细胞的机能。
宿主细胞也会对病毒的感染做出相应的反应。
宿主细胞可以通过产生抗病毒蛋白、启动免疫应答等方式来抵抗病毒的侵入。
然而，某些病毒可以通过多种机制来逃避宿主细胞的免疫反应。
病毒载体概述培训课件
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
第十七章 病毒基因工程
第一节 病毒载体
1.1 动物病毒载体
1.2 植物病毒载体
1.3 噬菌体载体
1.1 动物病毒载体
1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 1.1.7 SV40载体 痘苗病毒载体 反转录病毒载体 慢病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 杆状病毒载体
1.1.1 SV40载体
1.1.3 反转录病毒载体
1.1.3.1 反转录病毒
反转录病毒(retrovirus)为单链RNA病毒，可高效地感染 许多类型的宿主细胞。 病毒进入细胞后，其基因组RNA反转录成双链DNA， DNA进入宿主细胞核并整合在细胞染色体中，且以此 为模板合成病毒基因及子代基因组RNA，然后装配成 病毒颗粒。 反转录病毒基因组大约10kb，含有三个最重要的基因， 即gag(编码核心蛋白)、pol(编码反转录酶)和env(编码病 毒外膜蛋白)，并依次由5’向3’方向排列。 env基因中含有病毒包装所必需的序列，同时两端存在 长末端重复区(LTRS)，用于介导病毒的整合。
s v40 ge nom e 5243 bp
T-antigen VP1
图17-2 SV40 病毒基因组物理图谱及转录示意图
由于SV40病毒包装十分严格，不能包装大 于SV40基因组的DNA分子，因此外源基因 只能通过取代病毒本身的DNA片段进行克 隆。其克隆外源片段的能力有限，只能达 到约2.5kb。
1.1.2 痘苗病毒载体
痘苗病毒(vaccinia virus)为感染哺乳动物细胞的双链线性 DNA病毒，基因组大小在180kb左右，其中有30kb左右为 非必须区，可以被外源DNA片段取代而不影响病毒的复制 与繁殖。 痘苗病毒容易培养、相当稳定并能在大多数哺乳动物细胞 中复制繁殖，因此是一种理想的病毒载体。 由于其基因组很大，因此只能通过先将目的基因克隆到到 转移载体上，然后将重组转移载体与野生型痘苗病毒DNA 共转染哺乳动物细胞，在细胞内发生同源重组而获得重组 痘苗病毒。 由于痘苗病毒本身是一种高效活疫苗，当将一种或者几种 外源基因引入该病毒时，能够构建出多价疫苗株，同时预 防几种病原微生物引起的传染病，这是目前痘苗病毒载体 最吸引人的特点。
071005微生物学专业博士生培养方案(精)
071005 微生物学专业博士生培养方案一、培养目标博士生的培养应贯彻“面向世界，面向未来，面向现代化”的指导思想，坚持质量第一，德、智、体全面发展的方针。
具体要求博士学位研究生做到：1、较好地掌握马列主义、毛泽东思想、邓小平理论和“三个代表”的重要思想，拥护党的基本路线，热爱祖国，遵纪守法，品德高尚；学风严谨，具有较强的事业心和献身精神，积极为社会主义现代化建设事业服务。
2、在微生物学学科上掌握坚实宽广的基础理论和系统深入的专门知识（包括具有一定的相关学科的知识）；具有独立从事科学研究工作的能力；在科学或专门技术上做出创新性的成果。
3、身心健康。
二、研究方向1、微生物发酵工程重点研究有关微生物的次生代谢途径，探索特定产物的遗传和生理调控机制，探讨其发酵条件和提取工艺，开发微生物发酵新产品。
2、固氮微生物资源与分类重点研究豆科植物根瘤菌的资源与分类。
收集保藏我国各种自然条件下、各种豆科植物的根瘤菌菌株，采用现代分类技术对其进行性状分析和多相分类研究，从而弄清我国根瘤菌资源的特性和分类地位，完善根瘤菌的分类系统；探讨根瘤菌及根瘤菌—豆科植物共生体的起源与进化；为生产用菌种进行自然选育和遗传改造。
3、固氮微生物生化主要研究固氮微生物固氮酶的结构与功能的关系，研究固氮与放氢的关系，以认识固氮酶的本质。
4、微生物基因工程研究对象是禾本科植物联合共生的固氮螺菌以及大豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌，目的在于构建抗逆、高效固氮的遗传工程菌株，分离与抗铵和耐盐有关的基因，并研究其调控机理。
5、药用及食用真菌从真菌资源中筛选具有高活性的抗病生物活性物质，对其进行生化特性及免疫学特性分析，克隆生物活性物质的基因，为肿瘤、艾滋病及其他疾病的防治提供理论基础。
6、真菌遗传运用现代分子生物学技术，分析真菌异核体之间的差异，探索真菌的系统发育和遗传机制。
7、微生物降解与环境微生物从多种生态环境中筛选具有高降解力的微生物菌株，研究褐煤等有机物的降解和利用。
《分子生物学载体》课件
03
基因敲除与基因沉默的意义
用于研究基因功能、治疗遗传性疾病和癌症等疾病，具有重要的科学和
医学价值。
基因治疗与基因疫苗
1 2 3
基因治疗
利用分子生物学载体将正常基因导入到病变细胞 中，替代或修复缺陷基因，实现治疗疾病的目的 。
基因疫苗
利用分子生物学载体将抗原基因导入到受体细胞 中，表达出具有免疫原性的蛋白质，用于预防和 治疗疾病。
详细描述
病毒载体通常由病毒的基因组DNA或RNA以及外源基因的插入位点组成。通过 将病毒载体导入宿主细胞，可以实现外源基因的高效转移和表达。病毒载体在基 因治疗和疫苗开发等领域具有广泛应用。
人工染色体载体
总结词
人工染色体载体是一种人造的染色体，用于克隆和表达大片段DNA。
详细描述
人工染色体载体通过人工构建的方式模拟天然染色体的结构和功能，可以容纳大片段的外源DNA。人 工染色体载体具有稳定遗传、高容量等特点，适用于克隆和表达大型基因组片段以及功能基因组学研 究。
02
常用分子生物学载体介绍
质粒载体
总结词
质粒载体是一种小型环状DNA分子，常用于基因克隆和表达 。
详细描述
质粒载体具有自我复制能力，可以在宿主细胞内独立于染色 体进行复制，并且可以稳定遗传。质粒载体通常包含多个限 制性酶切位点，用于插入外源DNA片段，同时还有选择标记 基因，用于筛选含有目的基因的克隆。
风险评估与控制
进行全面的风险评估，采取必要的措施控制潜在的风险。
知情同意
确保受试者充分知情并自愿参与研究，签署知情同意书。
隐私保护
采取措施保护受试者的隐私和个人信息，防止泄露。
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生物制药
病毒载体PPT课件
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
32
第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
分子病毒学 8病毒载体
精选2021版课件
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Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
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Modification of the tropism of adenovirus vector
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
• Non-viral vector based
– Naked DNA (plasmid DNA): injection or genegun – Liposomes (cationic lipids): mix with genes
• Ex-vivo • In vivo
精选2021版课件
2
Why use viral vectors
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins
– Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
Receptors
–AAV2 Heparan Sulphate
分子生物学载体课件
• 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制 子，便于基因能在两种不同的受体细胞中 复制。
• 探 针 质 粒 筛选克隆或寻找基因元件。
23
如何阅读质粒图谱
• 1.首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真 核/穿梭质粒）
• 2.再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 1 Ampr 水解β －内酰胺环，解除氨苄的毒性。 2 Tetr 可以阻止四环素进入细胞。 3 Camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失 去毒性。 4 neor（Kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418 （卡那霉素衍生物）失活 5 Hygr 使潮霉素β 失活。
40
T4 Bacteriophage
41
42
2.2 噬菌体的生活周期（有两种）
1. 溶菌周期 —— 烈性噬菌体（virulent phage) 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重
新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量 子代噬菌体。 2. 溶原周期 —— 温和噬菌体（temperate phage)
• 2.8kb
• 元件来源 ① 复制起点：pBR322的 ori ② Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克 隆位点。
③ lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的α-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多 种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能 灭活下游lacZ基因。
3 温控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
温度低（低于37 ℃），拷贝数很少； 温度增加（>40 ℃）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
病毒载体概述之欧阳家百创编
病毒载体概述欧阳家百（2021.03.07）引言基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。
病毒载体概述之欧阳引擎创编
病毒载体概述欧阳引擎（2021.01.01）引言基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。
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host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
4
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
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Early generations of adenoviral vector (replication defective)
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Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
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Modification of the tropism of adenovirus vector
• Gene replacement: non-essential genes of
virus are deleted and exogenous genes are inserted
3
Generation of viral vector for gene therapy
• Replication-competent virus • Replication-defective virus
• Non-viral vector based
– Naked DNA (plasmid DNA): injection or genegun – Liposomes (cationic lipids): mix with genes
• Ex use viral vectors
Receptors –AAV2 Heparan Sulphate –AAV5 Sialic Acid
6
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8
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11
Generation of adeno-associated virus vector
12
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Characteristics of AAV vector
• Advantages
16
Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
(L1-L5)
• Causes a benign respiratory infections in human • Serotypes 2 and 5 are commonly used as vectors
herpesvirus) for replication (dependovirus)
• AAV-2 mostly used for vector
5
Adeno-Associated Virus
• Single Stranded DNA Virus
–Viral ITRs & Rep / Cap –~ 5kb Capacity
(AAV)
• Integrating / Concatameric
–Long Term Expression
• Complex Production &
Purification –Multi pDNA &/or Helper Virus –Lower Titre Than Adenovirus
• Serotype Differences In
viral vector
1
Methods of gene delivery
• Viral Vectors:
– Adenovirus – Retrovirus – Lentivirus – Adeno-associated virus (AAV) – Herpes simplex virus (HSV)
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
• Modify the fiber protein
20
Characteristics of adenoviral vector
– Integration and persistent expression – No insertional mutagenesis – Infecting dividing and nondividing cells – Safe
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression