分子病毒学实验方法

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分子生物学实验方法

分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。

常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。

提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。

常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。

2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。

PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。

反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。

PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。

3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。

转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。

转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。

4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。

常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。

表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。

以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。

这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。

病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]

病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。

操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。

各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。

每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。

有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。

呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。

在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。

许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。

实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。

与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。

采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。

同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。

各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。

许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。

尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。

此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。

如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。

将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。

如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。

将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。

组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。

如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。

经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。

分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】

可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

pcr技术原理实验步骤和应用过程

pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。

它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。

PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。

PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。

具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。

2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。

3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。

4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。

5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。

PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。

通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。

2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。

通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。

这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。

3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。

通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。

这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。

常见分子生物学实验方法

常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。

常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。

这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。

2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。

通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。

PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。

3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。

常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。

基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。

4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。

常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。

5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。

基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。

6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。

常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。

DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。

7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。

通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。

8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。

通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。

分子生物学常用实验方法原理介绍

分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

此方法简单易行,操作方便。

注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。

其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。

三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。

四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

病毒分子生物学鉴定常用技术

实验二十三病毒核酸检测常用技术（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses inCommon Use ）近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。

由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。

在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。

实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸【目的要求】通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。

【基本原理】鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。

但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。

常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。

本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。

病毒核酸的提取、扩增

防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2 、 Ca2 的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。
注意事项
尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；
减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；
减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。
• 为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式
核酸的纯化应达到以下三点要求
1.核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 2. 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 3. 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然

分子实验步骤

RNA的提取包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。

RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。

由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。

RNA制备的条件与环境为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。

对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA 制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin 与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。

另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase 的变性、水解与灭活。

总RNA的分离与纯化由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。

在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。

pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。

病毒的研究方法

三、组织和细胞培养技术
指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。
1、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生长繁殖的能力。
群体培养（左）和克隆培养（右）
群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。
细胞病变效应（CPE）
由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。
3、细胞培养的基本条件
细胞接种数：接种传代细胞一般为10—30万/ml 合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640， Eagle’s MEM。酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致。无菌条件培养器皿的处理
聚合酶链反应（PCR）转印杂交：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白质组学：肽图谱基因组学：核酸序列测定及基因功能基因工程：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽、病毒载体
特点：相间无物质传递
离心
常用于病毒的纯化
A:等速度沉降，B:等密度沉降
2、传质分离
平衡分离过程：
蒸发、蒸馏、吸收、萃取、结晶、离子交换、吸附、干燥、浸取、泡沫吸附等传质分离速率控制分离过程：气体扩散热扩散电渗析电泳反渗透微滤、超滤和纳滤
3、反应分离
可逆反应（如离子交换、反应萃取）；不可逆反应（反应吸收、反应结晶）；分解反应（生物分解、电化学反应、光化学反应）等。

分子生物学常用实验技术及方法

第二章常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl ，其中含有：模板DNA 0.5 µlPCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl10×MgCl 2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl无菌去离子水加至 50 µl上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。

循环参数为： 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退火1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。

二、基于PCR 技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和DNA片段2；3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：片段1 1 µl片段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O至50 µl在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。

分子病毒学实验方法

病毒学研究方法
诊断技术的发展历史
20世纪60、70年代免疫学技术-电镜-动物实验-细胞培养: 20世纪80年代分子生物学:
HBV，HAV ，HDV HCV ，HEV
1995年美国GBV-C/HGV ？ 1997年日本TTV (Transfusion Transimitted Virus) ？最近 SEN (在一位首写名为SEN的HIV静脉吸毒者患者血液中发现了一种新的DNA病毒) ？
Fibroblasts in culture
Epithelial cells in culture
Cytopathic effect induced by adenoviruses
Uninfected cells
Infected cells
Measles virus - induced polykaryocytes
Influenza virus, negative stain
X线晶体衍射法
分子生物学方法
Polymerase Chain Reaction (PCR)
ustcwhm@
Kary B. Mullis
*One Friday night I was driving, ……. My girlfriend, Jennifer Barnett, was asleep. I was thinking. ……. *However, shocking to me, not one of my friends or colleagues would get excited over the potential for such a process. *In September I did my first experiment. I like to try the easiest possibilities first. So one night I put human DNA and the nerve growth factor primers in a little screw-cap tube with an O-ring and a purple top. I boiled for a few minutes, cooled, added about 10 units of DNA polymerase, closed the tube and left it at 37°. It was exactly midnight on the ninth of September. *The first successful experiment happened on December 16th. I remember the date. It was the birthday of Cynthia, my former wife from Kansas City, who had encouraged me to write fiction and bore us two fine sons. I had strayed from Cynthia eventually to spend two tumultuous years with Jennifer.

分子病毒学

复制学习目标学完本章内容后，你应该能做到以下几点：理解病毒基因组是如何决定它的复制方式的实质。

描述一个典型的、广义的病毒复制周期。

比较七类主要病毒的复制模式。

概述病毒的复制由于我们对病毒的认识发生了变化，因此导致了病毒的分类方式发生了改变：1、按疾病：许都古老文明，例如古埃及和古希腊人对许多不同种类的病毒的致病效果都有很清楚的认识。

这个时候人们就有几种关于人、动物和庄稼疾病的令人惊讶的描述，尽管在这时候还没有关于应对这些灾难的药剂的实质性研究。

尽管这些描述都很精确，但是像这样根据这些疾病进行系统分类的一个主要问题是许多不同的病毒会导致相同的症状；例如，伴有发烧的呼吸感染可能是由许都不同的病毒导致的。

2、按形态学：随着病毒分类数的增加，病毒分析技术也在提高，从1930年到1950年，基于病毒颗粒的结构将病毒进行分类成为可能。

尽管在先前的计划中这是一种进步，但是在区分导致不同的临床症状的许多在形态学上相似的病毒方面还存在许多问题。

在这一时期，血清学在病毒区分中成为一个非常重要的助手，颗粒形态研究一直是病毒分类的一个重要方面。

3、功能的划分：在近些年，人们更注重于对病毒复制策略的研究。

在病毒基因组的组成和结构方面显得尤为突出。

病毒基因组的分子水平分析使对于单个病毒株的迅速而明确的鉴定成为可能，同时也预示了拥有常见的基因结构的以前未知的或异常的病毒的性能。

从目的论的观点来看，病毒复制的基础目标是复制遗传信息。

因此病毒基因组在决定哪一步是达到这一目标的必要条件方面具有卓越的性质。

事实上，在这一过程中会发生大量的令人惊奇的变化，甚至是表面上看基因结构相似的病毒。

产生这种现象的原因在于划分，既有真核细胞的细胞核和细胞质隔室，又有病毒基因组和宿主细胞的遗传信息生物化学能力。

细胞被病毒感染的模式对于复制过程有着深远的影响意义。

对于宿主细胞是原核生物的病毒，复制可以简单反映它与宿主细胞的相关程度。

对于真核生物的宿主，关联更加频繁和复杂。

考研生物学掌握分子生物学实验技巧

考研生物学掌握分子生物学实验技巧分子生物学实验技巧是考研生物学方向学习的重要内容之一。

掌握这些实验技巧不仅可以提高实验效果，还能够加深对分子生物学理论的理解。

本文将介绍一些常用的分子生物学实验技巧，并提供相关实验操作步骤。

一、核酸提取技术核酸提取是分子生物学研究中的基础步骤，是从生物样本中提取目标核酸的过程。

常用的核酸提取技术包括酚-氯仿法、盐法、离心柱法等。

以下以酚-氯仿法为例介绍核酸提取的步骤：1. 准备好待提取的生物样本，如细菌、真核细胞等。

2. 将待提取样本加入适量细胞破碎缓冲液中，充分破碎细胞膜，释放目标核酸。

3. 加入等体积的酚-氯仿混合液，轻轻摇晃离心管，使两相充分混合。

4. 离心，分离出上清液（含有核酸）和有机相（含有脂质和蛋白质）。

5. 将上清液转移至新的离心管中，加入异丙醇，使核酸沉淀。

6. 离心，去除上清液，加入70%乙醇洗涤核酸沉淀。

7. 离心，去除乙醇，空气干燥，使核酸沉淀完全干燥。

8. 加入TE缓冲液（含有EDTA），重溶核酸。

二、聚合酶链式反应（PCR）技术PCR技术常用于扩增DNA或RNA片段，通过对靶标序列的特异性扩增来检测其存在与否，进而实现基因检测、基因表达分析等。

以下是PCR技术的基本步骤：1. 准备好待扩增的DNA样本，配制PCR反应体系。

2. 加入适量的DNA模板、引物和聚合酶到PCR反应管中。

3. 开始PCR反应，依次进行Denaturation（解旋）、Annealing（退火）、Extension（延伸）等步骤，使DNA模板被扩增。

4. 反复进行PCR循环，通常进行30-40个循环。

5. 结束PCR反应，保存PCR产物用于后续实验。

三、蛋白质表达和纯化技术蛋白质表达和纯化是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于获得大量纯化的目标蛋白质。

以下是蛋白质表达和纯化的基本步骤：1. 根据需要，选取合适的宿主表达系统，如大肠杆菌、酵母等。

2. 构建重组表达载体，将目标蛋白质基因插入表达载体中。

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述邵碧英(福建出入境检验检疫局　福州　350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。

CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。

广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。

1　以病毒外壳蛋白为基础的检测方法植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。

血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。

111　酶联免疫吸附反应(EL ISA)EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。

酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。

该方法已被用于各种植物病毒检测。

后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。

几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。

EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。

112　斑点免疫吸附法20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。

也已用于各种病毒检测。

斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。

113　直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。

改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。

鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。

病毒学研究的方法和技术

病毒学研究的方法和技术病毒学是研究病毒的学科，主要关注病毒的生物学特性、分类、传播和致病机制。

病毒学的研究方法和技术种类繁多，本文将按照其研究方向和用途进行介绍。

一、病毒分类和鉴定方法病毒分类是研究病毒的基础，也是为寻找针对特定病毒的治疗手段提供重要依据。

常用的病毒分类方法包括形态学分类、生物物理化学分类、分子生物学分类等。

其中最具代表性的是分子生物学分类方法。

该方法通过对病毒遗传物质的DNA或RNA序列进行分析，建立起了病毒系统发育树，依依分类病毒，如爱滋病病毒(HIV)、流感病毒等。

利用PCR扩增技术可以快速鉴定出病毒特异性DNA/RNA序列，为病毒的快速检测和鉴定提供了重要的技术支持。

二、病毒核酸和蛋白质的分离与分析方法分离和分析病毒核酸和蛋白质是研究病毒基因组和蛋白质组成为了进一步探究病毒的生物学特性和致病机制。

常用的方法包括电泳分离、质谱分析、荧光定量PCR等。

其中，电泳分离技术被广泛应用。

根据不同的电泳方式，电泳分离技术可以分为凝胶电泳、毛细管电泳和微流管电泳等。

凝胶电泳主要用于分离病毒核酸和蛋白质；毛细管电泳主要用于分析病毒核酸序列；微流管电泳则可在微量样品中分离和分析病毒核酸和蛋白质。

质谱分析技术主要用于检测病毒蛋白质的质量、结构、组成，提供理论支持和新的治疗靶标；荧光定量PCR则是目前病毒检测中最常用的一种快速检测技术，尤其适用于新型冠状病毒检测。

三、病毒培养和检测方法病毒培养技术是研究病毒生长和复制规律的基础。

通过极端条件下的体外培养，可以从体外获得大量相同的病毒实验体，实现对病毒生物学特性的深入分析以及寻找针对特定病毒的治疗手段的研发。

病毒的检测技术主要分为传统检测和分子检测两大类。

传统检测方法包括免疫荧光技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，主要基于病毒特异性蛋白质或其他病毒成分的检测；分子检测技术则主要利用PCR方法，检测病毒特异性DNA或RNA序列，如RT-PCR、LAMP等。

分子生物学实验方法

分子生物学实验方法
分子生物学实验方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的技术手段。

以下是常用的分子生物学实验方法：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过体外DNA扩增技术来复制DNA 片段的方法，可以快速、高效地扩增特定DNA序列。

2. 基因克隆：通过将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子，再将重组DNA导入到宿主细胞中，从而得到大量目标DNA的方法。

3. 电泳：电泳是一种利用电场将DNA、RNA或蛋白质分子按照大小和电荷进行分离的方法。

常用的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4. 蛋白质表达与纯化：通过在宿主细胞中表达目标蛋白质的基因，然后利用蛋白质的特异性结构、功能或抗体亲和纯化技术，从宿主细胞中纯化目标蛋白质。

5. 免疫沉淀：利用抗体与特定蛋白质结合来纯化对应的蛋白质复合物的方法。

6. 荧光显微镜：利用荧光探针标记目标生物分子，通过荧光显微镜观察和分析分子在细胞或组织中的位置和数量。

7. Northern blot和Western blot：用于检测和分析RNA和蛋白质的方法。

Northern blot可以检测特定的RNA序列，Western blot可以检测特定蛋白质。

8. 基因敲除和基因转染：通过基因敲除技术可以去除或禁止特定基因的表达，而基因转染技术可以将外源基因导入细胞中，从而改变细胞的表型。

9. 蛋白质相互作用分析：利用蛋白质相互作用分析技术，如酵母双杂交、质谱分析等，研究蛋白质之间的相互作用关系。

这些方法是分子生物学研究中常用的实验技术，可以用于从分子水平解析生物学问题，探索生物的结构和功能。

病毒学实验技术

病毒学实验技术实验一鸡胚接种器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）一．精卵的选择、孵育和检卵1.受精卵的选择1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2）最好是白克蛋3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

2.孵育1）孵箱温度保持37.5—38.5℃2）相对湿度：50-60%3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次3.检卵孵育后第4天开始，每天检卵一次。

4日卵可见血管。

未受精卵不见血管鸡胚。

死胚血管模糊，无胎动。

二．鸡胚的结构1．卵壳上有细孔，以行气体交换2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3．气室呼吸和调节压力—卵壳孔交换4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O25．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。

6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水7．卵黄早期养分8．卵白晚期养分三．接种前处理1．做接种记号2．消毒四．接种途径卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下2）碘及酒精消毒气室端3）钢锥在气室中央锥一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚方法二：1）2）同一3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚5）封孔，续孵，弃24h内死胚2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒2）在气室端开一1.5×1.5口3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3）在气室端中央钻一个小孔4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2）钢锥锥一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二．实验步骤：1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次4.剪碎近于乳糜状5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。

分子常用实验方法

Lab217分子实验指南2目录1提取动物基因组DNA (3)1.1试剂盒提取基因组DNA (3)2提取RNA及反转录 (5)2.1TRI ZOL法提取RNA (5)2.2利用RNA反转生成C DNA (6)3目的基因信息的获取 (7)3.1利用网络资源获取目的基因信息 (7)3.2引物设计 (7)4链式聚合反应（POLYMERASE CHAIN REACTION，PCR）扩增特定DNA片段 (8)4.1PCR反应体系 (8)4.2PCR反应条件： (8)5琼脂糖凝胶电泳及目的片段回收 (10)5.1琼脂糖凝胶电泳 (10)5.2琼脂糖凝胶回收 (10)6DNA片段连接 (11)6.1PCR产物（加A）与T载体连接 (11)6.2PCR产物（平末端）与B载体连接 (11)6.3两DNA片段（相同粘性末端或平末端）连接 (11)6.4两DNA片段（不同粘性末端）连接 (11)7目的基因的克隆 (13)7.1质粒转化 (13)7.2质粒的少量提取 (13)7.3质粒的酶切鉴定及获得目的片段 (13)7.4测序 (14)8载体构建 (15)3 1.1试剂盒提取基因组DNA（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0/4.0）操作方法（以Ver. 4.0试剂盒为例）细胞或组织裂解后全套操作约需20 分钟（如果组织需要裂解，则所需时间因组织不同而不同），分为组织或细胞裂解、DNA 与膜结合、DNA 纯化等步骤，不同样品组织提取DNA方法说明如下：1.组织或细胞的裂解，使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下：◆动、植物组织的裂解：①取2～30 mg的动物组织或25～100 mg植物组织，臵于2 ml tube 中，用剪刀尽可能地剪成碎块，对于一些质地坚硬的组织也可以进行液氮研磨。

②加入180 μl 的Buffer GL、20 μl 的Proteinase K 和10 μl的RNase A（10 mg/ml），于56℃水浴温浴至组织完全裂解（2~3 小时，难裂解的材料可以适当延长裂解时间甚至过夜裂解，植物材料可能残存纤维状组织无法完全裂解，不影响DNA 提取）。

分子生物学基本实验操作

1.1.2.2 其他
RNA酶很难被灭活，实验过程中要时刻注意防止RNA酶污染。实验操作者的手也是RNA酶最主要的潜在污染源之一，因此，在实验准备和 RNA抽提过程中，都应戴手套，并尽可能勤换手套。实验室RNA相关实验用的仪器及试剂应该专用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制品和电泳槽等，并存放在指定地点。

1.1.3.5 RNA质量检测质量检测
（2）纯度和产量分析：计算A260/A280的比值R来判定RNA的纯度：用DEPC- ddH2O溶解RNA，1.6<R<1.8，认为RNA的质量较好； R<1.6时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显； R>1.8时，说明RNA降解比较明显。根据1A260单链RNA=40ng/ul计算RNA产量。

1.3.2 质粒质粒DNA的抽提步骤的抽提步骤
菌夜重悬
质量检测
裂解
沉淀，洗沉淀，涤，溶解
质粒复性，质粒复性，蛋白沉淀
氯仿抽提

1.3.2 质粒DNA抽提步骤质粒DNA抽提步骤
1、取2ml过夜培养的菌夜于EP管中，4℃，离心收集菌沉淀； 2、将细菌沉淀重悬于200µl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀； * 一定要使细菌分散均匀 3、加200µl新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒数次混匀（不可剧烈振荡），并将离心管置冰上2-3min，使细胞壁充分裂解（离心管中菌液逐渐变得透明且粘稠）； *此步时间不宜过长，混匀不能剧烈，否则基因组DNA 断裂，造成污染 4、加入200µl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min；

1.3.2 质粒质粒DNA抽提步骤抽提步骤
6、加入500µl的氯仿，混匀，4℃，12000rpm离心10min； 7、小心移去上请，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置5min，4℃， 12000rpm离心15min，可见质粒DNA沉淀； 8、小心弃上清， 1ml预冷的70%乙醇悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5min，重复此步一次； 9、室温干燥沉淀5-10min，视沉淀多少加入灭菌 ddH2O溶解沉淀