第十四章 病毒学实验技术

第三篇病毒学实验技术实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。

实验一实验须知一、实验室注意事项1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。

2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。

在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。

3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。

4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。

5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。

6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。

7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。

8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。

二、病毒材料收集、运送和保存（一）材料的收集分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。

采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。

各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。

由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。

－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。

有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。

对于棉拭子标本，折断放入2 ml pH7.4等渗平衡盐溶液的小瓶内，内含0.2%的明胶或牛白蛋白，青霉素、链霉素每毫升含100 u、100 μg；对于粪便、脓汁、鼻液等分泌物或渗出物，除在等渗平衡盐溶液含高浓度青、链霉素〔1000 u（μg）/ml〕外，还加2.5 μg/ml 的两性霉素B(或40 μg/ml的制霉素）；对脑等组织材料可放在50%甘油缓冲液中。

标本最好在冷藏的条件下尽快送到实验室。

病料要填写标签、临床病史和初步诊断。

（二）病毒材料的运送和保存供分离病毒用的材料，要尽快送到实验室。

如距离较远，可将熔封的材料容器放入冰筒，加冰块，盖严实后运送。

如无法获得冰块时，可用冷水加入氯化铵（NH4Cl）按3：1的比例倒入冰筒内搅拌1-3分钟，使溶解后，再放入熔封的材料容器，封闭瓶口运送。

病毒材料的保存：病毒标本必需及时处理，接种动物或培养，否则应将标准保存在-25℃至-70℃的低温冰箱或-196℃的液氮中。

病毒和病毒株真空干燥保存。

长期保存病毒，一般应用下述两种方法：1．快速低温冰冻：于灭菌悬液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加一些二甲基亚砜（5～10％），并迅速冷冻和保存于―70℃或―196℃。

含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；先浸入50%的甘油缓冲液盐水中，再行低温保存，效果更好。

2．冷冻干燥：在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水。

通常用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去凝器内尚未凝结的多余水汽。

通常用的的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶。

干燥毒种的保护剂，一般应用脱脂牛奶、灭活正常动物血清、饱和蔗糖溶液等。

真空干燥时，将病毒悬液与5－10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5 ml，立即放入事先预冷的－30℃～－40℃酒精中冻结1～2 h，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。

充分干燥后，打开干燥器取出毒种安瓶，再抽真空并封口。

这样冻干的毒种，一般可在4℃冰箱内保存几年至十年以上。

以上冷冻干燥可在真空干燥机里进行，十分方便。

（三）病料的处理1．咽喉拭子：放入盛有2～5ml Hanks液的容器内，内含2%犊牛血清和相应浓度（200～500 u或μg/ml）的青、链霉素。

通过机械震动，并反复冻融3～5次后，以2000 rpm离心10～20分钟取上清液即可。

2．脑、肝、肌肉等器官或组织：充分剪碎后置乳钵中加石英砂（或玻璃砂）研磨，或置组织研磨器磨碎而制成1︰10的悬液，常用稀释液有pH7.2～7.6的PBS，pH7.2～7.6的肉汤，10%脱脂乳盐水，0.5%乳汉液（乳蛋白-Hanks液），每毫升含有青、链霉素200 u或200 μg。

反复冻融3～5次（－20℃下的酒精中迅速冰冻，37℃温水中融化）后，以2000 rpm 离心取上清即可。

如中性甘油保存的标本，先用生理盐水冲洗后再研磨。

3．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物：用含青、链毒素的Hanks液（每ml含1000 u或1000 μg）将其稀释3～5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内过夜，离心取上清。

4．粪便：用含青、链毒素（1000 u或1000 μg/ml），含2%犊牛血清的Hanks液，4℃过夜，离心取上清。

5．无菌的体液或鸡胚液等：不作任何处理，可直接用于接种。

Orf virus的复壮、收毒及保存一、病毒液的制备取脓疱痂皮，充分剪碎置乳钵中加玻璃砂（或石英砂）研成粉末，用pH7.2的PBS或生理盐水按1︰10比例制成悬液，内含500 u和500 g的青、链霉素，－20℃，37℃反复冻融3次，2000 rpm以上离心后，取上清液进行无菌检验（需氧和厌氧培养24小时以上）后即可。

二、易感动物从非疫区选用1周岁以下的绵羊羔，越小越好。

三、接种动物1．动物准备：先将羊腹下和股内侧剪毛、脱毛，用水洗刷干净，再用灭菌水冲洗一次，擦干。

2．在羊腹下和股内侧皮肤上用灭菌针头连续划痕，以不划透皮肤，刚见到一点血丝为好。

3．将前所制备的病毒液涂擦在划痕处，均匀涂布，完毕后，等水份蒸发干后，将放开。

4．感染羊要隔离饲养严防散毒。

四、采毒时间及方法羊感染后一般在3～4天后开始出疹，4～6天后出现水疱，6～8天后出脓疱。

采毒可在水疱期－脓疱期之间进行，当完全化脓，甚至结痂之后病毒滴度下降。

采毒方法直接用刀片刮下皮痂，装入灭菌容器内，写明标签。

五、保存本病毒耐干燥，在保存中，将装病料的容器置于装有干燥剂（如氯化钙）的容器内，密封，置于低温冰箱或超低温冰箱保存。

保存时间可达一年以上，2年时还有一定毒力。

据有些书籍记载可存活15年之久。

附：真空冰冻干燥法，可见《新实验病毒学》P22～23。

参考文献1．戴华生等编著. 新实验病毒学.中国学术出版社，1983，20～232．殷震，刘景华. 动物病毒学（第一版）.科学出版社，1985，275～276实验二 细胞培养用水的制备及检测要搞组织培养，水质的优劣是成败的关键。

组织培养用的各种洗液和溶液，需用三蒸水或去离子水配制。

三蒸水的第三次蒸馏应在玻璃蒸馏器内进行。

水的纯度在用水质检测仪测定时，电阻应在150万欧姆以上，才能用于组织培养。

兰州兽医研究所细胞培养用水在1000万欧姆左右。

我们教研组细胞培养用水的制备程度是：蒸馏器—蒸，—蒸水再经过去离子交换树脂柱，去离子水（可达200～500万欧姆）。

这种程序所制备的水，可供小型实验室用水。

兰州兽医研究所细胞培养用水的制备程序是：自来水先通过滤器粗滤，可以滤除一些肉眼可见的物质，如一些泥土颗粒等，再经过电渗仪，可将一些大颗粒的物质和一些无机盐离子去除，电渗过的水再经去离子交换树脂柱除去阴、阳离子，经检测合格后可用于组织培养。

这种程序适用于大生产用水或供许多实验室用水。

一、去离子水的制备去离子水有人也叫无离子水，但这种称呼不太恰当，因为去离子水还是含有一些阴、阳离子，并非无离子。

（一）去离子水的制备原理离子交换柱内装有苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂和苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂。

阳树脂可交换水中的阳离子，阴树脂交换水中的阴树脂，从而使水中的无机盐正、负离子得以去除，而达到水质净化的目的。

树脂的合成过程：乙烯（CH 2＝CH 2）使苯烷基化→乙苯→苯乙烯→橡胶、树脂。

l C H H H Cl -++--++-−−−→−−−→−阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生加交换＋H ＋OH － ＋ 阴离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生交换-++--++-−−−→−−−→−Na OH OH NaOH 阴树脂有一定的除去水中热原能力（蛋白性的热原在pH 7.0时带负电），故去离子水可作为注射用水。

一般认为去离子水电阻值大于50万欧姆·厘米，作为注射用水均可。

（二）离子交换柱的类型1．联合式：阳离子交换树脂柱（4公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——混合树脂柱（阴树脂1公斤，阴树2.5公斤）。

2．混合式：1根混合树脂柱。

3．复合式：阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱。

见图3。

三种离子交换柱优缺点类型优点缺点联合式水量大，水质好，pH值稳定处理麻烦，树脂用量大。

混合式树脂用量少，设备简单，出水块，水质高，pH值稳处理麻烦定。

复合式处理容易水质、pH值都不如上两种。

我们教研组现采用复合式＋混合式的类型。

我们现采用的离子交换器柱容量小，出水质量不稳定，树脂再生处理频繁。

要制备优质的去离子水，除选择适当的类型外，更重要的是交换柱容量要大。

在一定容量下，柱的直径大出水量多，柱子越长，水质越好，反之出水量少，水质差。

在选用离子交换柱时一定遵守这个原则。

（三）离子交换树脂的酸碱再生法1．方法一：（1）混合柱中树脂的再生混合柱中树脂−−→−倒出用25%氯化钠溶液，分离出阴、阳离子交换树脂（阴性树脂漂在上面，阳性树脂沉在水底）−−→−树脂去除污场用25%氯化钠溶液−−倒出氯化钠反复用蒸馏用蒸馏水分别浸泡到第二天分别浸泡阴、阳性树脂12小时−−−−水冲洗至无咸味−→−−−−−−−−→−树脂处理。

−−阳性树脂处理：用7%盐酸溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。

浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将酸水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH3～4即可。

阴性树脂处理：用8%氢氧化纳溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。

浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将碱水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH8～9即可。

处理好的树脂，可分别装成阴离子交换柱和阴离子交换柱，或阴性树脂和阳性树脂按1.7︰1的比例充分混匀后装成混合柱。

（2）新树脂的处理新树脂常混入一些低聚物、色素、灰沙等异物，必须认真处理除去，否则将影响今后制水的质量和产量。

①漂洗。

用水质软的常水，反复漂洗树脂，以除去其中的色素、水溶性杂质、灰尘等。