常规病毒学实验技术
病毒培养方法
病毒培养方法
病毒培养是一种重要的实验技术，它在病毒学研究、疫苗生产和药物筛选等领域都有着广泛的应用。
正确的病毒培养方法可以保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
下面将介绍一种常用的病毒培养方法，供大家参考。
首先，准备培养基和细胞。
常用的培养基有DMEM、MEM等，细胞可以选择HEK293、Vero等。
将培养基加热至37摄氏度，使其保持体温。
其次，接种病毒。
将培养基加热后，将其放置在无菌工作台上。
然后，将需要接种的病毒加入培养基中，轻轻摇匀。
接着，将接种好病毒的培养基加入到细胞培养皿中。
将培养皿放置在37摄氏度的恒温培养箱中，培养一定时间。
在培养的过程中，需要定期观察细胞的情况。
通常情况下，细胞会出现明显的变化，比如颜色的改变、细胞的增殖等。
这些都是培养是否成功的重要指标。
最后，收获病毒。
当细胞出现明显的病毒感染迹象时，可以收获病毒。
首先，将细胞培养液离心，离心后的上清液中含有病毒。
然后，将上清液收集起来，经过一系列的离心、过滤等步骤，最终得到纯净的病毒溶液。
总的来说，病毒培养是一项复杂的实验技术，需要严格的操作流程和高超的实验技巧。
只有掌握了正确的病毒培养方法，才能够保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
希望以上介绍的病毒培养方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]
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病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。
操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。
每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。
呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。
在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。
许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。
实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。
与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。
采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。
同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。
许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。
尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。
此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。
如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。
将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。
如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。
将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。
如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。
经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。
病毒学研究中的实验技术
病毒学研究中的实验技术病毒学是研究病毒性疾病的科学。
病毒性疾病的病原体是病毒，而病毒无法自行进行代谢活动，必须寄生在宿主细胞内完成其生命活动，因此病毒性疾病是难以治愈的。
病毒学家通过从分子层面研究病毒的结构、生命周期和致病机制等方面，探究病毒感染机制和防治策略。
但是病毒性疾病的研究需要大量的实验技术支持，下面介绍一些病毒学研究中常用的实验技术。
一、细胞培养技术病毒感染的第一步是入侵宿主细胞，因此病毒学研究中不可避免地涉及到细胞培养技术。
细胞培养技术是把生物组织或细胞通过培养基、营养物质等条件模拟人体内环境来培育或生长。
常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和三维细胞培养。
原代细胞培养是将组织切碎后通过酶的作用将细胞分离培养，有原始细胞的特点；细胞系培养是通过连续传代保留的一种相同的细胞群体，细胞系一般在细胞数目增高到一定阶段会停滞不生长，从而要定期传代；三维细胞培养则是将细胞以3D结构的形式培养，可以模拟更接近真实环境的细胞生长。
二、病毒制备技术病毒制备技术是研究病毒性疾病的基础。
制备好的病毒才能在实验中进行感染、药物筛选等研究。
病毒制备技术不同于普通的细胞培养技术，主要包括以下步骤：选择适宜的病毒感染细胞、制备病毒原液、病毒上清的浓缩、纯化和滤过等。
在实际制备中，还需要时刻注意环境卫生和安全控制等因素，保证实验和研究的可行性和可靠性。
三、病毒感染实验技术病毒感染实验技术是研究病毒性疾病的核心。
病毒感染实验技术主要包括病毒感染模型建立、病毒感染实验的设计、病毒感染后的分析与诊断等。
在病毒感染实验中，常常使用到Green Fluorescent Protein (GFP)、Luciferase、β-galactosidase等荧光物质和化学指标来评估病毒感染情况和细胞的生长状态。
此外，病毒感染实验中还会运用到PCR、Western blot等分子和蛋白质分析技术来探究感染机制和影响。
四、病毒抗原与抗体的检测技术病毒的抗原与抗体检测是病毒学研究的重要环节。
病毒技术实验报告
病毒技术实验报告引言近年来，随着信息技术的快速发展，病毒技术也逐渐成为网络安全领域的研究热点之一。
通过对病毒技术的深入研究，可以加强对现有病毒的分析和防范能力，提高网络安全的水平。
本实验旨在通过深入了解和实践病毒技术，以期对病毒的工作原理、传播途径和防御方法有更全面的认识。
实验目的1.了解病毒的工作原理和分类；2.学习病毒的传播方式和繁殖特性；3.掌握病毒的防御方法和安全措施。
实验步骤1. 病毒的工作原理病毒作为一种恶意软件，其主要功能是通过自我复制和传播感染目标计算机系统，给系统带来破坏和损失。
病毒的工作原理可以分为以下几个步骤：•感染阶段：病毒会通过感染病毒携带者（例如邮件附件、下载文件等）进入目标系统，并在系统中寻找可感染的目标文件；•激活阶段：病毒感染目标文件后，等待触发激活条件，例如特定的日期、时间等；•执行阶段：一旦激活条件满足，病毒会开始执行其恶意功能，例如删除文件、传播自身等。
2. 病毒的分类根据病毒的传播方式和破坏程度，病毒可以分为以下几类：•文件病毒：通过感染可执行文件或系统文件来传播，例如EXE、DLL 等；•宏病毒：通过感染办公软件中的宏来传播，例如Word、Excel等；•蠕虫病毒：通过网络传播，自我复制和传播，例如蠕虫病毒可以通过电子邮件、文件共享等途径感染目标系统；•特洛伊木马：外表看起来正常或有吸引力的程序，但在运行时会执行恶意功能；•广告病毒：通过在用户浏览器中显示广告来获取经济利益。
3. 病毒的传播途径和繁殖特性病毒的传播途径主要有以下几种：•邮件附件：病毒常通过电子邮件附件传播，用户在打开或下载附件时可能被感染；•下载文件：用户在下载可疑的文件时可能会下载并运行病毒；•移动存储设备：病毒可以通过USB闪存驱动器等移动存储设备传播；•网络共享：病毒可以通过共享文件夹在局域网内传播。
病毒的繁殖特性也不尽相同，有的病毒具有自我复制和传播的能力，有的病毒则需要依靠人工操作来传播。
病毒学实验
实验一病毒对细胞的感染目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照；4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。
实验二病毒的扩增与收集目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。
通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况；5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管；6、4℃，12000rpm,10min，取上清；7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃.实验三病毒的敏感性测定目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。
本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。
材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅步骤：1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）；2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取下层备用；同样，取等量病毒不加乙醚于4℃同样处理备用（空白对照）；3、高温预处理：取一定量病毒悬液于55℃处理30min后备用；同样，取等量病毒于4℃处理30min备用（空白对照）；4、分别取适量经氯仿、乙醚、高温处理及未处理的病毒悬液感染Sf9细胞；5、28℃培养24-48h，对照观察细胞感染效率。
病毒的研究方法
三、组织和细胞培养技术
指从机体中取出组织或细胞，模拟 机体内的生理条件在体外进行培养， 使之生存和生长。
1、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细 胞提供一个良好的生存环境，使细胞 对环境产生适应性，获得生长繁殖的 能力。
群体培养（左）和克隆培养（右）
群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。 克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶 中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增 殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。
细胞病变效应（CPE）
由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变 效应。
3、细胞培养的基本条件
细胞接种数：接种传代细胞一般为10—30万/ml 合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640， Eagle’s MEM。 酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。 温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体 温一致。 无菌条件 培养器皿的处理
聚合酶链反应（PCR） 转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白质组学：肽图谱 基因组学：核酸序列测定及基因功能 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子 多肽 、病毒载体
特点：相间无物质传递
离心
常用于病毒的纯化
A:等速度沉降，B:等密度沉降
2、传质分离
平衡分离过程：
蒸发、蒸馏、吸收、萃取、结晶、离子交换、吸附、 干燥、浸取、泡沫吸附等 传质分离 速率控制分离过程： 气体扩散 热扩散 电渗析 电泳 反渗透 微滤、超滤和纳滤
3、反应分离
可逆反应（如离子交换、反应萃取）；不 可逆反应（反应吸收、反应结晶）；分解 反应（生物分解、电化学反应、光化学反 应）等。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（一）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出气室和胚位2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）用钢锥穿一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（⼀）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（⼆）优点组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。
（三）接种途径1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。
②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。
④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。
⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。
⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。
⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）⽅法⼆①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。
②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。
③滴⼊接种物。
④⽤透明胶纸封闭开⼝。
2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。
病毒学研究中的重要技术方法
病毒学研究中的重要技术方法病毒学是对病毒进行研究和控制的学科，其研究范围涉及病毒的结构、生物学特性、病理学、免疫学、疫苗与治疗的研究、流行病学调查等多个方面。
为了更好地进行病毒学研究，科学家们不断创新并发展出了许多重要的技术方法。
本文将介绍其中几个重要技术方法。
1. 病毒培养技术病毒培养技术是研究病毒生物学特性、病理学和制备疫苗等研究领域必不可少的技术。
其主要通过在宿主细胞中进行体外培养来进行。
常用的宿主细胞有鸡胚、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等。
其中，哺乳动物细胞培养技术在研究人类病毒方面具有极大的应用价值。
通过病毒培养技术，病毒生长繁殖的规律以及影响其繁殖的各种因素都可以研究和控制。
一些病毒在宿主细胞中生长繁殖的特性也可以通过病毒培养技术进行研究。
因此，病毒培养技术是病毒学研究的重要基础技术。
2. 病毒检测技术病毒检测技术是对病毒进行检测和诊断的重要技术。
目前常用的病毒检测技术主要包括免疫学方法、分子生物学方法及电子显微镜技术等。
在病毒学研究中，不论是对研究病毒引起的疾病的发病机理还是对病毒流行病学进行研究，都需要采用病毒检测技术。
3. 病毒分离技术病毒分离技术是病毒学研究中非常重要的技术。
它主要通过对病人样品、动物组织或者其它环境样品进行分离和纯化，从中分离出病毒。
此外，病毒分离技术还可以用于评估疫苗的效力以及研究病毒变异的规律性。
通常的病毒分离技术主要包括细胞传代法、小鼠传代法、囊泡传代法、鸡卵传代法以及临床样品直接分离法等。
在现代病毒学中，主要采用的是细胞传代法。
4. 基因芯片技术近年来，基因芯片技术在病毒学研究中的应用越来越广泛。
这项技术主要基于生物芯片技术、分子生物学技术和计算机技术等。
它将许多基因片段集合在一起制成芯片，通过对样品核酸的杂交实验可以检测到基因相应片段与芯片上的匹配。
基因芯片技术在病毒感染后机体免疫应答、病毒基因特征、宿主基因不同表达情况等方面提供了全面的信息。
因此，基因芯片技术在病毒学研究中扮演着越来越重要的角色。
第五章 病毒学检验基本技术
第五章病毒学检验基本技术第一节病毒的形态结构和化学组成病毒（Virus）是超显微的、无细胞结构的、只含一种核酸(或DNA或RNA)、只能在活细胞内存活的寄生物。
病毒在活细胞外以病毒粒子的形式存在，不能进行代谢和繁殖，不具有生命特征，但一旦进入宿主细胞就具有生命特征。
一病毒的形态大小（一）病毒的形态病毒一般呈球形或杆形，也有呈卵圆形、砖形、丝状和蝌蚪状。
动物病毒多呈球形、卵圆形或砖形，如腺病毒为球状，痘病毒为砖形；植物病毒多呈杆形或丝状，少数为球状，如烟草花叶病毒为丝状，苜蓿花叶病毒为杆状，花椰菜花叶病毒为球状。
细菌病毒即噬菌体多为蝌蚪状，也有为球状和丝状，如大肠杆菌偶数T噬菌体系列为蝌蚪状，大肠杆菌噬菌体fd为丝状（图5-1）。
图5-1 病毒的形态（二）病毒的大小病毒非常微小，以纳米（nm）表示。
较大的痘病毒直径约为300nm，较小的口蹄疫病毒颗粒直径为10～22nm。
二病毒的结构和化学组成及其功能病毒粒子(virion)是指一个结构和功能完整的病毒颗粒。
病毒粒子主要由核酸和蛋白质组成。
核酸位于病毒粒子的中心，构成了病毒的核心或基因组 (genome)，蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳(capsid) 。
核酸和壳体合称为核衣壳(nucleocapsid) ( 见图5-2)。
最简单的病毒就是裸露的核衣壳。
病毒形状往往是由于组成外壳蛋白的亚单位种类不同而致。
此外，在某些病毒的核衣壳外，还有一层囊膜(envelope)结构。
1 核酸核酸是组成各种病毒的核心。
一种病毒只含有一种类型的核酸,即DNA或RNA。
核酸可以是单股的，也可能是双股的；可以是线状的，也可以是环状的。
大多数病毒粒子中只含有一个核酸分子。
少数RNA病毒含两个或两个以上的核酸分子，而且各个分子担负着不同的遗传功能，它们一起构成病毒的基因组，所以这些 RNA 病毒为双组分基因组、三组分基因组或多组分基因组。
病毒核酸(即病毒基因组)储存着病毒的遗传信息，控制着其遗传变异、增殖和对宿主的感染性等。
第三部分病毒学实验方法
第三部分 病毒学实验方法病毒是微生物中体积最小的一种，绝大部分在普通光学显微镜下不能看到，需用电子显微镜才可查见。
由于病毒具有严格的寄生性，必须在易感的活组织(细胞)中才能增殖，故通常将其接种于动物(小鼠、家兔及猴等)、鸡胚胎或组织(细胞)中使之增殖，但并非所有标本均需依次接种于动物、鸡胚胎或组织培养中进行病毒的分离鉴定，而是根据具体情况而定。
有些病毒在寄生的细胞内增殖后可导致细胞病变，或可在受感染的细胞内形成形态学上特异的斑块，称为包涵体，此可用普通光学显微镜检视。
病毒性疾病常用的血清学检查法为血凝抑制试验、补体结合试验及中和试验。
近年来，随着科学技术的进展，在原有血清学检查技术的基础上，又建立了具有特异性强且敏感性又较高的新的血清学检测法，如荧光抗体检测技术，酶联免疫检测技术—EILSA及固相放射免疫技术等，在实际工作中，可随检查目的的不同而选不同的方法。
实验十五 病毒感染后的形态学观察一、电子显微镜技术病毒体积微小，不仅肉眼看不见，即使是分辨率最好的光学显微镜也只能看到个别的大病毒。
20世纪30年代初电子显微镜的发明，扩大了人们的视野。
在电子显微镜下，不仅能观察到各种病毒的外观，且可看清其结构。
为了观察病毒与细胞的关系。
一般将接种病毒的组织（细胞）培养固定，包埋后进行超薄切片，染色后进行观察；为观察病毒形态与结构，可用磷钨酸负染法。
(一)磷钨酸负染法磷钨酸负染法是利用重金属盐类溶液处理生物标本，使它在电镜下呈现出良好的反差。
经此种染色处理的生物标本。
在电镜下与正染色相反，观察到的不是亮环境下的黑色物象而是暗背景(重金属染液)下的亮象(物体)。
【材料】(一)病毒悬液。
(二)染液：磷钨酸盐(钠、钾)(三)铜网【方法】(一)用吸管吸取少量病毒悬液，直接滴在铜网上，一般每份标本3-4个铜网。
待3-5 min 后吸去悬液或用小片滤纸吸干。
然后用另一吸管吸染液滴于铜网上，待2-3 min吸去多余染液，待自然干燥后即可进行电镜观察。
病毒学检验实验教学大纲(供卫生检验专业使用)
《病毒学检验》实验教学大纲
（供卫生检验专业使用）
一、实验教学的指导思想和教学目的
在理论学习基础之上，培养学生病毒检测的基本实验操作技能，提高实验的综合设计、分析能力。
二、实验教学的基本要求
原代细胞制备技术和细胞传代技术：了解细胞的保存方法；病毒鉴定技术：掌握血凝和血凝抑制试验鉴定病毒的原理，细胞病变的判断方法；鸡胚培养方法和鸡胚不同途径接种方法：掌握尿囊腔接种和尿液收获方法。
每组4人。
三、实验教材
卫生部规划教材《病毒学检验》第一版（李洪源主编，北京：人民卫生出版社，2006年）。
四、实验考核
实验成绩：实验教学过程成绩、实验报告成绩和操作考试分别占30%、30%和40%。
五、实验项目表。
第5章病毒检验基本技术
第5章病毒检验基本技术第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。
病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲亚砜（DMSO）并防止反复冻融使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。
二、病毒的培养条件实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。
而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。
1、组织培养病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。
组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡后再清洗应用。
常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐、维生素和辅助生长因子等，常用的人工综合营养液为MEM何RPM I 1640.用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加入碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。
能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen 溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。
动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力。
细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。
生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。
这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。
病毒检验基本技术
第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送一、标本采集：采集时间为病程初期或急性期；二、标本的处理：应进行预处理三、标本的运送：1、病毒抵抗力弱，室温会很快灭活，应立即送实验室2、不能立即检测，放入冻存液并加甘油或二甲亚砜（DMSO），并防止反复冻融二、病毒的培养条件培养工具：实验动物、鸡胚、体外培养的器官和细胞一、组织培养病毒在细胞内的增殖及对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象及对细胞的作用及通过对“指示病毒”的感染等法加以判断。
1、培养的玻璃器皿的要求：用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡清洗后使用2、组织培养的营养液：成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助因子等常用的人工综合营养液：MEM、RPMI1640。
如用人工综合营养液配制细胞生长液要加如下物质：①、血清（适量）、谷氨酰胺溶液：动物血清含有细胞生长的各种营养因子，促进细胞贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力②、规定量的抗生素：防止细菌污染③、NaHCO3修正PH④、HEPES溶液（根据情况加入）:可使生长液具有较强的PH缓冲能力⑤、胰蛋白酶和EDTA溶液：使组织和成片细胞分散成单个细胞。
EDTA溶液又称为Versen溶液3、细胞培养液可分为细胞生长液（发育生长，营养丰厚）和细胞维持液（延缓代谢）生长液和维持液的区别：血清含量不同4、PH：7.2-7.65、全过程的技术关键：防止污染二、细胞株的保存含10%二甲亚砜的血清可作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞三、使用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞注：原代细胞核传代细胞的区别是是否能在体外无限传代四、细胞的纯化：细胞克隆技术三、病毒的常规实验室诊断一、病毒的分离与鉴定1、病毒增殖的判定2、细胞病变（CPE）:CPE的表现为细胞破坏、肿大、融合成合胞体、无明显变化等。
CPE常具有病毒种的特性，因此常作为病毒鉴定标准之一。
3、病毒蚀斑技术（空斑）：病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2
病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2病毒学实验技术 2 (2)接种和孵育用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的裂缝插入，滴加0.1~0.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。
严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。
接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。
蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。
继续孵育，使蛋壳窗向上。
另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下:在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。
用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。
随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。
当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。
(3)膜组织的收获将蛋平放，蛋壳窗向上。
用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。
用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。
用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。
因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚7、8日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。
接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。
随后用石蜡-凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。
此后按第一法所述方法进行孵育和收获。
4.羊膜(Amniotie)接种此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。
由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。
脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。
(1)日龄和准备用7~15日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。
按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。
(2)接种和孵育接种时应用lm1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。
将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。
第三章 病毒检验基本技术
第三章病毒检验基本技术一、形态学检验光学显微镜一般用于观察有些病毒在宿主细胞增殖后于细胞核内或细胞质内出现的包涵体。
胞质内包涵体：狂犬病毒（内基小体）、呼吸道合胞病毒（RSV）胞核内包涵体：巨细胞病毒（CMV），单纯疱疹病毒（HSV）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、腺病毒。
胞质内和胞核内包涵体：麻疹病毒电镜技术：电镜直接检查、免疫电镜二、培养与鉴定技术（金标准）进行病毒分离培养与鉴定的情况：1、需对疾病进行病原学的鉴别诊断2、发现新的病毒性疾病或再发性病毒性疾病3、病程长且诊断困难的病人疑似病毒感染时，病毒的分离培养对诊治疾病有指导性意义4、检测病毒减毒活疫苗效果（如及时发现回复独立的变异株等）5、病毒性疾病的流行病学调查6、病毒生物学特性的研究。
采集要求：早期采集，低温运送和保存（-20℃~-70℃），样本处理（高浓度抗生素—青链霉素处理过夜，或细菌滤膜过滤）培养：1、细胞培养：原代细胞培养、二倍体细胞培养、传代细胞培养2、鸡胚培养（一般采用9~12日龄鸡胚）（流感病毒、疱疹病毒、痘病毒）：羊膜腔接种、绒毛尿囊膜接种、尿囊腔接种、卵黄囊接种。
3、动物接种鉴定：1、病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标（1）细胞病变：细胞圆润、分散、溶解；细胞融合成多核巨细胞；细胞肿胀、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄串状；形成包涵体。
（2）红细胞吸附（流感病毒）（3）干扰现象（4）细胞代谢的改变2、病毒感染性测定和病毒数量测定（1）50%组织细胞感染量测定（2）红细胞凝集试验（3）空斑形成试验（最常用）（4）中和试验三、非培养检验技术1、免疫学检验技术：抗原检测（意义更大、早期）、抗体检测2、分子生物学检验技术:核酸杂交技术、聚合酶链反应技术、基因芯片技术、基因测序技术（对新基因进行测序）。
病毒学研究的方法和技术
病毒学研究的方法和技术病毒学是研究病毒的学科，主要关注病毒的生物学特性、分类、传播和致病机制。
病毒学的研究方法和技术种类繁多，本文将按照其研究方向和用途进行介绍。
一、病毒分类和鉴定方法病毒分类是研究病毒的基础，也是为寻找针对特定病毒的治疗手段提供重要依据。
常用的病毒分类方法包括形态学分类、生物物理化学分类、分子生物学分类等。
其中最具代表性的是分子生物学分类方法。
该方法通过对病毒遗传物质的DNA或RNA序列进行分析，建立起了病毒系统发育树，依依分类病毒，如爱滋病病毒(HIV)、流感病毒等。
利用PCR扩增技术可以快速鉴定出病毒特异性DNA/RNA序列，为病毒的快速检测和鉴定提供了重要的技术支持。
二、病毒核酸和蛋白质的分离与分析方法分离和分析病毒核酸和蛋白质是研究病毒基因组和蛋白质组成为了进一步探究病毒的生物学特性和致病机制。
常用的方法包括电泳分离、质谱分析、荧光定量PCR等。
其中，电泳分离技术被广泛应用。
根据不同的电泳方式，电泳分离技术可以分为凝胶电泳、毛细管电泳和微流管电泳等。
凝胶电泳主要用于分离病毒核酸和蛋白质；毛细管电泳主要用于分析病毒核酸序列；微流管电泳则可在微量样品中分离和分析病毒核酸和蛋白质。
质谱分析技术主要用于检测病毒蛋白质的质量、结构、组成，提供理论支持和新的治疗靶标；荧光定量PCR则是目前病毒检测中最常用的一种快速检测技术，尤其适用于新型冠状病毒检测。
三、病毒培养和检测方法病毒培养技术是研究病毒生长和复制规律的基础。
通过极端条件下的体外培养，可以从体外获得大量相同的病毒实验体，实现对病毒生物学特性的深入分析以及寻找针对特定病毒的治疗手段的研发。
病毒的检测技术主要分为传统检测和分子检测两大类。
传统检测方法包括免疫荧光技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，主要基于病毒特异性蛋白质或其他病毒成分的检测；分子检测技术则主要利用PCR方法，检测病毒特异性DNA或RNA序列，如RT-PCR、LAMP等。
病毒学实验技术
病毒学实验技术实验一鸡胚接种器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）一．精卵的选择、孵育和检卵1.受精卵的选择1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2）最好是白克蛋3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
2.孵育1）孵箱温度保持37.5—38.5℃2）相对湿度：50-60%3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次3.检卵孵育后第4天开始，每天检卵一次。
4日卵可见血管。
未受精卵不见血管鸡胚。
死胚血管模糊，无胎动。
二．鸡胚的结构1．卵壳上有细孔，以行气体交换2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3．气室呼吸和调节压力—卵壳孔交换4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O25．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。
6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水7．卵黄早期养分8．卵白晚期养分三．接种前处理1．做接种记号2．消毒四．接种途径卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下2）碘及酒精消毒气室端3）钢锥在气室中央锥一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚方法二：1）2）同一3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚5）封孔，续孵，弃24h内死胚2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒2）在气室端开一1.5×1.5口3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3）在气室端中央钻一个小孔4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2）钢锥锥一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二．实验步骤：1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次4.剪碎近于乳糜状5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。
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常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（一）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出气室和胚位2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）用钢锥穿一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
1）画出气室和胚位2）垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3）以钢锥在气室中央锥一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4．其它接种途径羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒组织培养原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。
继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。
原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）1）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。
2）用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。
3）加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。
如此反复冲洗2-3遍。
4）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。
5）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
6）用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。
7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
传代细胞系培养优点：1)可以无限的传代。
2)不少细胞系对病毒很敏感。
3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞分散剂1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2．乙二胺四乙酸二钠（EDTA）营养液1．人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2．血清1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。
2）促进细胞的贴壁和生长。
3）具有很强的酸碱缓冲作用。
（二）病毒感染力的滴定LD50，EID50，TCID50（TCID50的测定）1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。
2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。
3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。
4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法：高于50%的百分数-50% 91.6-50距离比例= = =0.8高于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82. Karber法病毒液稀释度出现CPE孔的比率10-1 8/8=110-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.12510-6 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验一、原理抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。
二、用途1. 疾病诊断。
2. 病毒分离株的鉴定。
3. 不同病毒株的抗原关系研究。
4. 疫苗免疫原性的评价。
5. 免疫血清的质量评价。
6. 测定实验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类（一）终点法中和试验1. 固定病毒——稀释血清法。
1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2) 在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。
一直到1:256），每个稀释度作4孔。
3) 在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用45min-60min。
4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。
5) 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6) 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法：血清稀释度CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数无CPE孔数保护率（%）1:4（10-0.6）0 4 0 9 1001:16（10-1.2） 1 3 1 5 831:64（10-1.8） 2 2 3 2 401:256（10-2.4） 4 0 7 0 01:1024（10-3.0） 4 0 11 0 0高于50%的保护率-50%距离比例=高于50%的保护率—低于50%的保护率83-50= = 0.783-40高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-1.2+0.77×(-0.6)=-1.66-1.66的反对数=1/46即：1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2. 固定血清——稀释病毒法。
1) 将病毒作连续10倍稀释1）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子，在一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作用1h。
2）然后在每孔中加入100μl细胞。
3）另外还设两纵排正常细胞对照。
4）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
5）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。
试验组TCID50中和指数=对照组TCID50(二) 蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。
用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。
2、蚀斑减数试验将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。
其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。
用途：（1）应用已知V鉴定未知V（2）应用已知免疫血清鉴定未知V（3）应用已知V鉴定未知血清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备1．脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。
2000rpm 10min，取上清作接种物。
2．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm 10min取上清作接种物。
3．咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。