PCR-RFLP实验设计经典方案(1)
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【仪器与试剂】 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机 4、单面刀片 5、恒温水浴锅
二、试剂
1、 DNA回收试剂盒 2、50×TAE 3、ddH2O
三、实验步骤
1)在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块,尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.5ml 离心管中。 2) 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液(本实验加 500ul),置55℃水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化,期间每2分钟颠例混匀一 次促溶。 3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱,12000rpm 室温离心1分钟,倒掉收集管 中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。 4)在吸附杜中加入500uI漂洗液,室温静置1分钟后, 12000rpm 室温离心30 秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。 5)再在吸附柱中加入500uI漂洗液, 12000rpm 室温离心15秒,倒掉收集管中 的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。 6) 12000rpm 室温空离心1分钟。 7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中,在吸附膜中央加入30ul洗脱缓 冲液,室温静置2分钟后, 12000rpm 室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗 脱一次),将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8)琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
实验操作流程图
切胶示意图
凝胶纯化结果示意图
注意事项:
切胶时应快速操作,在紫外灯下时间长容易伤害 到眼睛; 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量 放置于暗室,切带时应使用长波长紫外灯,切胶 时间尽量短。 胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的 回收率。 把洗脱液加热,使用时有利于提高洗脱液效率。
【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率?
实验六 PCR产物的胶回收分离纯化
满朝来
哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 生化与分Fra Baidu bibliotek生物学教研室
一、实验目的
1、了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理。
2、掌握PCR产物纯化的实验技术,为后续的连接 反应和转化反应打下良好的基础。
二、实验原理
首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段, 分离目的条带DNA,然后紫外光下切割含目 的DNA条带的胶块,利用胶回收试剂盒回收 纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊 硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、 专一地吸附DNA、RNA的原理,配备设计独 特的离心吸附柱式结构,使用常规台式高速 离心机,在几分钟之内即可以高效回收核酸 片段。