02-重组赖氨酰内切酶 重组赖氨酰肽链内切酶(Lys C)
重组赖氨酰内切酶
? 产品简介
赖氨酰内切酶（Lysyl Endopeptidase ，EC
3.4.21.50）属于丝氨酸蛋白酶，可特异性切割赖
氨酸残基羧基端的肽键。赖氨酰内切酶广泛用于
生物制药、生物分析、细胞培养等领域。
冀百康生物的系重组大肠杆菌表达、经多步分
离纯化后冷冻干燥而制成冻干粉，具有天然赖氨
酰内切酶相同的活力和特异性。本品为生物化学级别的基因工程酶，不含DFP 、PMSF 和TLCK
等酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF 等抑
制酶活，但金属离子螯合剂如EDTA 不会抑制酶活。本品为无标签的赖氨酰内切酶，与天然的赖氨酰内切酶具有相同的氨基酸序列。 一种高纯度、高活性、高特异性的重组蛋白水解酶
? 产品特性
活力单位：30℃， pH9.5条件下，每分钟催化底物生成1μmol 对硝基苯胺的酶量为1AU 。
? 产品优势
● 无动物源性：产品无病毒污染，生产过程不
使用任何动物来源的材料。 ● 符合BP2019和EP8.8的标准。
● 耐受性强：广泛的pH 耐受，较强的表面活
性剂耐受性。
● 生产规模1000L 以上。
● 质量稳定：可保证连续稳定的批量生产，批
间质量差异小。
● 合规性：生产设备和生产环境符合相关法规
要求，符合GMP 指导原则。
● 质量文件完整：按客户需求，可提供相关法
规支持文件。
SDS-PAGE电泳图谱35KD 27KD
?产品用途
●蛋白药物的生产，如胰岛素及类似物生产，
GLP-1类似物生产。
●蛋白质结构与功能研究，如蛋白质质谱、测
序、肽图谱分析。
●小分子蛋白或多肽的生产，如美容肽，抗菌
肽、食品风味肽的生产等。
●Lys-X化合物的酶催化合成。
●干细胞、原代细胞的培养，作用更加温和。
?使用方法
●推荐使用pH8.0~10.0的20mM Tris-HCl 溶
解冻干粉，酶：融合蛋白=2~100AU：1g，
最适pH9.0-10.0，最适温度25-35℃，反应
时间2~18h。
●注意事项：高于0.1M的无机盐对酶活性会
有一定的影响，建议脱盐后再进行酶切反
应。如无法脱盐，建议增加酶的用量并延
长酶切时间。
?产品规格
?运输和储存稳定性
●运输稳定性：冰袋保温运输，保证酶活稳定。
●储存稳定性：于-15℃~ -20℃储存，24个月内
稳定；当Tris-HCl缓冲液配制成酶溶液时，于-20℃储存反复冻融10次无活性损失，在4℃和-20℃能稳定存放一周。
?相关产品
重组赖氨酰内切酶（含组氨酸标签）冻干粉；重组胰蛋白酶冻干粉；重组羧肽酶B（含组氨酸标签）。重组赖氨酰内切酶用于融合蛋白的酶切
35KD 27KD
去胚轴对花生子叶肽链内切酶和贮藏蛋白质降解的影响
1999205214收到,2000204224接受。 国家自然科学基金资助课题。 3稿件联系人。 缩写 BAPNA :苯甲酰精氨酸对硝基苯胺;CHM :亚胺环己酮;PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS:十二烷基磺酸钠;SSP:盐溶蛋白。 去胚轴对花生子叶肽链内切酶和贮藏蛋白质降解的影响 宾金华13 傅家瑞2 (1华南师范大学生物系,广州510631;2中山大学生物系,广州510275) 摘要:从离体子叶与连体子叶在水中培养一段时间后的比较,看到它们之间在肽链内切酶活性和盐溶蛋白及花生球蛋白降解上的差异并不大,这表明去除胚轴对子叶肽链内切酶活性和贮藏蛋白降解的影响很轻微。亚胺环己酮(蛋白质合成抑制剂)不能完全抑制离体子叶肽链内切酶活性的提高,子叶的大部分大分子贮藏蛋白同样被降解。这表明,在花生种子萌发过程中降解大部分贮藏蛋白的子叶肽链内切酶并非全部是在种子萌发时新合成的,子叶贮藏蛋白降解和肽链内切酶活性基本不受胚轴调控,子叶与胚轴之间在调控关系上可能是一种新的调节类型。 关键词:花生,离体子叶,肽链内切酶,贮藏蛋白降解,亚胺环己酮学科分类号:Q945 肽链内切酶在萌发种子的贮藏蛋白质降解中 起重要作用,且与种子活力密切相关(Chrispeel 和Boulter 1975,Nielsen 和Liener 1984,宾金华和傅 家瑞1995,黄上志和傅家瑞1992)。它的合成及活性调节一直受到人们重视。双子叶的豆科植物和单子叶的禾本科植物中,多数为萌发后新合成,且前者与胚轴有密切关系,后者与胚分泌激素密切相关(Bewley 和Black 1985,Dunaevsky 和Belozer 2sky 1993,K oehler 和Ho1990,Shintani 等1997,Shutov 和Vaintraub 1987)。在花生子叶中此酶的合成和活性调节方式了解极少,以整粒花生种子为材料,我们已证明花生子叶肽链内切酶不是在种子萌发过程中新合成的(宾金华等1996a )。本试验用花生离体子叶为材料,拟进一步证明此酶的来源和活性调节方式。 1 材料与方法 1.1 植物材料 供试花生(A rachis hypogaea L.)为粤油2116 品种,由广东省农业科学研究院作物研究所提供。 选取中等大小种子,用1%次氯酸钠消毒5min ,蒸馏水冲洗6次后剥取子叶,将子叶置于垫有两层滤纸的培养皿中,加入适量蒸馏水后置黑暗中培养(28±1)℃。每一处理为20粒种子,每粒种子的 两片子叶分别培养,按规定天数取出子叶保存于-80℃中备用。一片子叶用于酶活性测定,另一片子叶用于贮藏蛋白质测定。亚胺环己酮(cyclohex 2imide ,CHM )为Sigma 产品,用蒸馏水配制成所需 浓度,加入培养皿中培养子叶,培养条件和操作步骤均同上。1.2 蛋白质提取和测定 蛋白质提取按照Yamada 等(1980)及黄上志和傅家瑞(1992)的方法进行。蛋白质含量测定按Bradford (1976)的方法进行,以牛血清蛋白作标准曲线。SDS 2PA GE 按照Laemmi (1970)及黄上志和傅家瑞(1992)的方法进行。 1.3 肽链内切酶提取和活性测定 取子叶按1∶5(W /V )加入预冷含β2巯基乙醇10μmol/L 的磷酸缓冲液(p H 7.2,20mmol/L ), 在冰浴中研磨成匀浆,4℃下浸提4h 后离心20 min (15000×g ,4℃ )。在上清液中加入硫酸铵使饱和度达80%,静置2h 后再离心(15000×g , 4℃,20min ),所得蛋白质沉淀溶于含β 2巯基乙醇10μmol/L 的醋酸缓冲液(50mmol/L ,p H 5.4),并在4℃中对该液透析24h 。经透析后的酶溶液离心(15000×g ,4℃,20min )除去不溶物,所得上清液即为酶提取液。 以BAPNA 为底物测定肽链内切酶活性,参照Harris 和Chrispel (1975)的方法,以波长410nm 下的OD 值每分钟每0.01为1个酶活性单位。电泳后检测肽链内切酶活性则按Jammel 等(1984)方法进行,但分离胶改为7.5%,明胶底物终浓度为0.8%。 2 结果 2.1 离体子叶肽链内切酶活性变化 5 64植物生理学报,Acta Phytophysiologica Sinica 2000,26(6):465～470
常用限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点
BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点
BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），简称限制酶，是一类能识别和切割双链 DNA 分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。 Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 ' 突出的粘性末端（ sticky ends ）；切割产生 3 ' 突出的粘性末端；切割产生平头末端（ blunt ends ）。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此，I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。 每种限制酶特异识别专一DNA序列，并在切割位点将其准确切割。 限制酶是基因工程用来切割目的基因的酶，DNA复制不需要。 DNA复制需要的是解旋酶和DNA聚合酶。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型 第一型限制酶：同时具有修饰（modification）及认知切割（restriction）的作用；另有认知（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距离认知位（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶：只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。 第三型限制酶：与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfⅢ。 甲基化（DNA methylation） DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点
BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
02-重组赖氨酰内切酶 重组赖氨酰肽链内切酶(Lys C)
重组赖氨酰内切酶 ? 产品简介 赖氨酰内切酶（Lysyl Endopeptidase ，EC 3.4.21.50）属于丝氨酸蛋白酶，可特异性切割赖 氨酸残基羧基端的肽键。赖氨酰内切酶广泛用于 生物制药、生物分析、细胞培养等领域。 冀百康生物的系重组大肠杆菌表达、经多步分 离纯化后冷冻干燥而制成冻干粉，具有天然赖氨 酰内切酶相同的活力和特异性。本品为生物化学级别的基因工程酶，不含DFP 、PMSF 和TLCK 等酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF 等抑 制酶活，但金属离子螯合剂如EDTA 不会抑制酶活。本品为无标签的赖氨酰内切酶，与天然的赖氨酰内切酶具有相同的氨基酸序列。 一种高纯度、高活性、高特异性的重组蛋白水解酶 ? 产品特性 活力单位：30℃， pH9.5条件下，每分钟催化底物生成1μmol 对硝基苯胺的酶量为1AU 。 ? 产品优势 ● 无动物源性：产品无病毒污染，生产过程不 使用任何动物来源的材料。 ● 符合BP2019和EP8.8的标准。 ● 耐受性强：广泛的pH 耐受，较强的表面活 性剂耐受性。 ● 生产规模1000L 以上。 ● 质量稳定：可保证连续稳定的批量生产，批 间质量差异小。 ● 合规性：生产设备和生产环境符合相关法规 要求，符合GMP 指导原则。 ● 质量文件完整：按客户需求，可提供相关法 规支持文件。
SDS-PAGE电泳图谱35KD 27KD ?产品用途 ●蛋白药物的生产，如胰岛素及类似物生产， GLP-1类似物生产。 ●蛋白质结构与功能研究，如蛋白质质谱、测 序、肽图谱分析。 ●小分子蛋白或多肽的生产，如美容肽，抗菌 肽、食品风味肽的生产等。 ●Lys-X化合物的酶催化合成。 ●干细胞、原代细胞的培养，作用更加温和。 ?使用方法 ●推荐使用pH8.0~10.0的20mM Tris-HCl 溶 解冻干粉，酶：融合蛋白=2~100AU：1g， 最适pH9.0-10.0，最适温度25-35℃，反应 时间2~18h。 ●注意事项：高于0.1M的无机盐对酶活性会 有一定的影响，建议脱盐后再进行酶切反 应。如无法脱盐，建议增加酶的用量并延 长酶切时间。 ?产品规格 ?运输和储存稳定性 ●运输稳定性：冰袋保温运输，保证酶活稳定。 ●储存稳定性：于-15℃~ -20℃储存，24个月内 稳定；当Tris-HCl缓冲液配制成酶溶液时，于-20℃储存反复冻融10次无活性损失，在4℃和-20℃能稳定存放一周。 ?相关产品 重组赖氨酰内切酶（含组氨酸标签）冻干粉；重组胰蛋白酶冻干粉；重组羧肽酶B（含组氨酸标签）。重组赖氨酰内切酶用于融合蛋白的酶切 35KD 27KD
常用限制性内切酶酶切位点
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点
BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。 限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
限制性内切酶的一般原则和建议!
限制性内切酶的一般原则和建议! 1．如何做酶切反应？ 该问题看似什么简单： DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前 3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。 10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2．如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？ 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全？从下面几个因素去考虑： 1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。我们公
高中生物各种酶的作用(精选.)
DNA连接酶连接DNA上黏性末端磷酸二酯键（扶手）基因工程拼接目的基因和运载体 DNA聚合酶把单个的脱氧核苷酸聚合成单链DNA 磷酸二酯键DNA复制 DNA解旋酶将双链DNA解旋为两单链氢键DNA复制、转录 RNA聚合酶把单个的核糖核苷酸聚合成RNA 磷酸二酯键转录 限制性内切酶识别特定的碱基序列并切割出黏性末端磷酸二酯键基因工程 DNA酶水解DNA（类似于蛋白酶） 蛋白质酶是指酶的成分是蛋白质的酶，和核酸酶相对应。 蛋白酶就是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，就是可以水解蛋白质的酶。 (酶的两大类：蛋白质酶，核酸酶) Taq聚合酶一般适用于DNA片段的PCR扩增 DNA解旋酶 在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，催化DNA双链结构解链，并具有ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。不同来源的DNA解旋酶的共同特性是通过水解ATP提供解链的能量，而复制叉结构的存在与否对活性的影响因酶而异。 在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，催化DNA双链结构解链，并具有ATP酶活性的酶。两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。不同来源的DNA解旋酶的共同特性是通过水解ATP提供解链的能量，而复制叉结构的存在与否对活性的影响因酶而异。 胰蛋白酶来自人的胰腺，胰腺在胃的中后部位，分泌的胰蛋白酶用来消化食物中的蛋白质，分解蛋白质成为肽，氨基酸等，再被人体肠道吸收到人体各组织中去，所以，胰蛋白酶在食物消化中起到至关重要的作用，是不可或缺的 胶原蛋白酶可以促进分解胶原蛋白 肠淀粉酶肠腺分泌的肠淀粉酶可以将什么水解成氨基酸 唾液淀粉酶可以促进淀粉的水解。 过氧化氢酶人体肝脏中的过氧化氢酶主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH 木瓜蛋白酶它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 顶体酶顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上，通常以无活性形式存在，当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原才被激活为顶体酶。此酶是受精过程中不可缺少的一种中性蛋白水解酶，其作用类似于胰蛋白酶，它能水解卵透明带糖蛋白，使精子穿过卵丘再穿过透明带，使精子与卵子融合;它还能促使生殖道中激肽释放，从而增强精子的活力和促进精子的运动。 最新文件仅供参考已改成word文本。方便更改 word.
限制性内切酶酶切位点汇总
限制性内切酶酶切位点汇AatII识别位点 Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点
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限制性内切酶分类指南
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I 和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究 限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA 不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但只甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。这样，限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统。在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能;而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。 传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。 I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。以前人们认为I型限制性内切酶很稀有，但现在通过对基因组测序的结果发现这一类酶其实很常见;尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带，因而不具备实用性。 II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于dna分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。 II型限制性内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列;但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列(如EcoR I识别GAATTC);而另一些识别不连续的序列(如Bgl I识别GCCNNNNNGGC)。限制性内切酶的切割后产生一个3"羟基端和一个5"磷酸基团。它们的活性要求镁离子，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开DNA。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一 类内切酶。 限制性核酸内切酶的分类： 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一 型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定 碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较 高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 第三型限制酶 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与 认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如： EcoPI、HinfIII。 限制酶在遗传学方面的应用： 1、在甚因工程方面 利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一 限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面 ? （1）目的基因与载体的重组 细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助 才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛 选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片
其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 核酸内切酶 核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。[1] 寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核 酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。 RNA聚合酶 科技名词定义 中文名称：RNA聚合酶 英文名称：RNA polymerase 定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）
定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。 逆转录酶 科技名词定义 中文名称：逆转录酶 英文名称：reverse transcriptase 其他名称：依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase,RNA指导的DNA聚合酶 (RNA-directed DNA polymerase) 定义：编号：EC 2.7.7.49。以RNA为模板催化脱氧核苷-5′-三磷酸合成DNA的酶。在逆转录病毒及其他某些病毒中发现有此类酶。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
EcoR I限制性内切酶
Eco R I G A A T T C C T T A A G TaKaRa Code：D1040A 包 装 量：4,000 Units 附带试剂： 10×H Buffer 500 μl 10×Loading Buffer 500 μl 纯 度： 1） Overdigestion Test：≥12 Units 2） Ligation-Recutting Test： Ligation Effi.：100%,Recutting Effi.：100% 3） pKF3 Cloning Test：＜2% ●酶贮存液： 10 mM Tris-HCl, pH7.5 100 mM KCl 0.1 mM EDTA 1 mM DTT 0.01 % BSA 0.15 % TritonX-100 50 % Glycerol ●起 源：Escherichia coli RY13 ●一般反应体系： Eco R I 1 μl 10×H Buffer 2 μl DNA ≤1 μg 灭菌水 up to 20 μl ●反应温度：37℃ ●反应时间： 在上述20 μl的反应体系中，37℃反应5分钟可以完全切断λDNA，满足各种实验需求。针对特殊酶切底物DNA，如果得不到良好的酶切效果时，可以将反应时间延长至1小时。 ●活性确认： 在50 μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 ●纯度检测： 1） Overdigestion Test：在1 μg DNA中加入过量的该限制酶，进行长时间（24小时）酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。 2） Ligation-Recutting Test：在经过10倍量该酶切出的DNA片段中，加入 T4 DNA Ligase，使其连接，然后再使用该酶进行切断反应，判断Ligation-Recutting效率。 3） pKF3 Enforcement Cloning Test：使用10倍量的该酶，将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开，然后再进行连接后，转化至TH2感受态细胞中，判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。 ●在各种Universal Buffer中的相对活性： L M H K T（+BSA）相对活性(%)(20)(100) 100 (120) (80) ●各种DNA的切断数： ●甲基化的影响： 根据识别序列后续碱基的不同，有时受CG methylase影响。 ●Star活性： 高甘油浓度、Mn2+存在、低离子强度条件下，识别序列会发生变化。如果在反应液中添加Spermine （0.2 mM左右），活性降低20～30%，但可以抑制30～50%的Star活性。 ●Basal Buffer组成： 100 mM Tris-HCl, pH7.5 7 mM MgCl2 50 mM NaCl 7 mM 2-Mercaptoethanol 0.01 % BSA ●Universal Buffer组成（-20℃保存）： 1.10 × L 100 mM Tris-HCl,pH7.5 4.10 × K 200 mM Tris-HCl,pH8.5 100 mM MgCl2100 mM MgCl2 10 mM Dithiothreitol 10 mM Dithiothreitol 2.10 × M 100 mM Tris-HCl,pH7.5 1,000 mM KCl 100 mM MgCl2 5.10 × T 330 mM Tris-Ac,pH7.9 10 mM Dithiothreitol (BSA 100 mM Mg-Ac 500 mM NaCl －Free) 5 mM Dithiothreitol 3.10 × H 500 mM Tris-HCl,pH7.5 660 mM K-Ac 100 mM MgCl2 6. 0.1% BSA 10 mM Dithiothreitol 7. 0.1% Triton X-100 1,000 mM NaCl ●10×Loading Buffer组成 （开封后室温保存） 0.9% SDS 50% Glycerol 0.05% Bromophenol Blue 使用时添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。-20℃保存时，会出现SDS沉淀，请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请在温水浴中溶解后使用。 λ Ad2SVφX pBR pUC pUC M13Col 40174322 19 119 mp18E1 5 5 1 0 1 1 1 1 1 V2010.10
限制酶使用说明
限制酶使用说明 一、分类 目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类： 类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco K II 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。 二、注意事项 1. 甲基化的影响 从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况： 在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。 2. Star活性 限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度