单克隆抗体制备常见问题分析
单克隆抗体的几个问题
单克隆抗体的几个问题一杂交瘤细胞的第二次筛选要进行抗体检测阳性！1骨髓瘤细胞同效应B细胞融合后产生的细胞不一定可以分泌抗体，即该基因不一定会表达出来，所以要筛选出可以分泌抗体的杂交瘤细胞. 2杂交细胞有多种（被免疫生物B淋巴细胞又百万种）单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。
单克隆抗体制备常见问题分析
单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。
我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体的制备及调试思路
• 免疫的动物和骨髓瘤细胞系的选择
• 用杂交瘤技术生产单克隆抗体，需要三种用途 的实验动物，第一是提供脾脏细胞的动物，供 融合使用，第二种动物是用于制备腹水瘤，第 三种动物是提供饲养细胞，三种动物必须是同 一类，而且跟我们使用的瘤细胞是同一系的， 这是因为不同种系的细胞进行杂交融合的成功 率较低，而且会出现单相染色体丢失的自然排 出的现象，我们公司统一使用的是BALB/C小 鼠。
4 单克隆抗体的制备流程
制备流程
融合
克隆 扩大培养
5单抗面临的问题
• 抗体的抗干扰的能力较差----有解决的希 望
• 抗体的稳定性较差 • 融合率较低 • 灵敏度差
二 调试的思路 • 喹乙醇稳定性----逆向思维
• β-呋喃果糖苷酶的调试过程 1 包被液的选取 2 抗体稀释液的选取 3 标准品稀释液的选取 从少到多的原则 4 酶稀释液的选取
单克隆抗体的制备及调试思路
单克隆抗体
• 当动物体受抗原刺激 后可产生抗体。抗体 的特异性取决于抗原 分子的决定簇，各种 抗原分子具有很多， 因此，免疫动物，抗 原决定簇所产生的抗 体实为多种抗体的混 合物。
1 单克隆抗体的基本概念
• 抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合 成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的 过程中通过随机重排只产生识别一个抗 原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万 种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同 基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
• 这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性， 它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性， 也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存
的特性，用这种来源于单个融合细胞培
养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决 定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久〞地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量〞的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、本钱低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反响，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反响强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
“单克隆抗体”学习中的几个问题分析
“单克隆抗体”学习中的几个问题分析“单克隆抗体”是动物细胞工程的重要内容，动物细胞融合技术的重要应用就是制备单克隆抗体，学生对这项现代生物技术既充满兴趣又深感抽象，教材仅以“单克隆抗体制备过程示意图”和简单的文字描述来介绍，因而要达到课标要求的理解、综合应用水平，还需有一定的背景知识，如：免疫学基础，细胞融合过程及其对性状表达的影响等知识。
基于此，本文围绕这些问题进行分析解答，以便于师生教与学。
1.一种抗原能使机体产生几种抗体免疫学告诉我们抗原是指能引起机体发生特异性免疫反应的任何物质或病原体，包括自身的衰老、损伤细胞和癌变细胞。
抗原具有异物性、大分子性和特异性的特点。
其特异性与抗原分子表面和分子内部的特定的化学基团——抗原决定簇有关。
一般，一个抗原分子具有多个抗原决定簇，如：流感病毒有40多个，白喉类病毒有8个。
抗原决定簇是免疫细胞识别抗原的重要依据，也是诱导淋巴细胞分化的刺激因素，又是同相应抗体结合的部位。
抗原注射到人和哺乳动物体内，一个B淋巴细胞只能接受一种抗原决定簇的刺激，分化为效应B 淋巴细胞和记忆细胞，并能产生与该抗原决定簇特异性结合的特异抗体。
即一种抗原决定簇指引起一种特异抗体，因而一种复杂的抗原进入机体后，可刺激机体不同的B细胞分化产生多种抗体。
这些抗体各不相同，只能与相应的抗原决定簇结合，因而都可以和该抗原结合，但结合部位不同，即一种抗原引起机体产生多种特异的抗体，但每一个效应B淋巴细胞只能产生其中一种特异的抗体。
这样血清抗体就是由多个不同的B淋巴细胞应答一个抗原的结果，即不同淋巴细胞产生的特异抗体能与该抗原的不同抗原决定簇结合，因此，血清抗体纯度低、灵敏度低、特异性差。
单克隆抗体是由同一种B淋巴细胞群体（克隆化）合成并分泌的，这些抗体均一，只识别同一种抗原决定簇，因而特异性强、灵敏度高。
2.为什么在得到杂交瘤细胞后，还要进行抗体检测和筛选经过选择培养基筛选，得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需的特异抗体。
关于_单克隆抗体_中相关问题的探讨_陈颜
是人淋巴细胞中有这两种 DNA 的合成途径， 但一般 不分裂增殖。 而鼠骨髓瘤细胞中虽然没有 S 途径，但 能不断分裂增殖。
因此，在 HAT 培养液中，未融合的效应 B 细胞和 B 淋 巴 细 胞 —B 淋 巴 细 胞 融 合 细 胞 的“ D 途 径 ”被 氨 基喋呤阻断，虽“ S 途径”正常，但因缺乏在体 外 培 养 液中增殖的能力，一般 10 d 左右会死亡。 而骨髓瘤细 胞 自 身 没 有“ S 途 径 ”， 且“ D 途 径 ” 又 被 氨 基 喋 呤 阻 断，所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。 唯 有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互融合形成的杂交瘤 细胞，在 HAT 选择性培养基上，既具有效应 B 细胞的 “ S 途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增 殖的特性，因此能在 HAT 培养液中选择性存活下来， 并不断增殖，这就是所需的杂交瘤细胞。
液中， 放置了多个骨髓瘤细胞与多个多种 B 淋巴细 胞，由于动物细胞融合是一个随机的过程，所以经融 合后细胞将以多种形式出现。如果只考虑两两融合的 情况， 会有融合的骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞、B 淋巴 细胞—B 淋巴细胞、B 淋巴细胞—骨髓瘤细胞以及未 融合成功的单个骨髓瘤细胞、单个的 B 淋巴细胞。 那 么如何从众多的细胞中筛选出杂交瘤细胞呢？
现就学习过程中，学生难以理解的知识点加以分 析总结，以帮助学生正确理解相关知识。 1 传统制备抗体的缺点及理解
长期以来，人们为了获得抗体，传统的方法是向 动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后 从动物的血清中分离所需的抗体。 这种方法不仅产 量低，纯度低，而且制备的抗体特异性差。 采用传统 方法制备的抗体为什么产量低，纯度低，而且特异性 差？
从众多类型的细胞中筛选出杂交瘤细胞，普遍采 用的 HAT 选择性培养基， 也就是在普通的动物细胞 培养液中加入次黄嘌呤（ H） 、氨基喋呤（ A） 和胸腺 嘧 啶核苷酸（ T） 。 已知细胞中的 DNA 合成有两条途径。 ① 生物合成途径（“ D 途径”） ，即由氨基酸及其他小 分子化合物合成核苷酸， 为 DNA 分子的合成提供原 料。 ② 应急途径或补救途径（“ S 途径”） ，是利用次黄 嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（ HGPRT） 和胸腺嘧啶 核苷激酶（ TK） 催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相 应的核苷酸，然后再合成 DNA，两种酶缺一不可。
单克隆抗体的制备
第十一章单克隆抗体的制备1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monlclonalantibody,McAb）。
迄今世界已研制成数以千计的McAb。
单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易，所以一问世便受到欢迎和重视。
在医学领域中，McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。
为此，两位发明者于1984年获得诺贝尔医学奖。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。
脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理后见），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列几个主要步骤阐明。
（一）细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的碑细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
目前常用的B细胞瘤株有：P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，1975)，P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)，X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等，这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]
![单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/9a194bfd6394dd88d0d233d4b14e852458fb39b0.png)
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的H A T选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DN A合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HA T培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
杂交瘤单克隆抗体制备常见问题解答
杂交瘤单克隆抗体制备常见问题解答1. 小鼠腹腔制备的单克隆抗体为什么不能直接用于人体治疗?要如何才能?小鼠的单克隆抗体是属于鼠源性的,如果直接用于人体,人的机体免疫会有严重的排斥反应,从而引起不良反应,甚至死亡,所以非人源化得抗体是不能直接用于人体的.你可以将小鼠抗体的FC段置换成人的,可以逃避掉,但是这样也就会导致抗体杀伤能力减弱,因为FC段不是可以和一些补体之类的结合吗?所以也有弊端。
2. 制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？答：因为B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。
因此将二者融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性。
3. 杂交瘤细胞注射入小鼠体内为了得到单克隆抗体.既然瘤细胞可以无线增殖?难道不会导致小鼠的死亡?在把杂交瘤细胞注入小鼠体内前,要提前打入石蜡油或是不完全佐剂的,数量也会增殖,不会形成实体瘤,可以诱导机体产生腹水。
4. 有关单克隆抗体在单克隆抗体制备实验中,大致过程是将抗原注射到小鼠体内,然后从小鼠脾脏中获得能够产生抗体的B淋巴细胞,然答：这个B淋巴细胞就是效应B细胞,书上不是加了限定词么“能产生抗体的”2.LZ要明确一点,不是只要是融合的细胞,它就一定能表达,可能会因为诸多因素使得融合细胞不能分泌抗体,这是个复杂的过程.所以这一步是确定融合细胞能够表达（即分泌抗体）,才能投入使用.像基因工程的最后一步,不就是目的基因的检测与表达么,作用是相同的.5. 单克隆抗体制备过程中,将某种抗原注入小鼠体内,从小鼠脾脏中只能获得一种产生抗体的B淋巴细胞这句话肯定是错误的,“只能获得一种产生抗体的B淋巴细胞”,脾脏中有很多种B淋巴细胞的,怎么可能只有一种呢再问：抗原不是一种吗，就只需产生一种抗体呀再答：脾脏中有很多种抗原的，包括以前自身就具有的啊！这是它的脾脏里面的6. 请问：什么是全人单克隆抗体?与人源单克隆抗体有什么区别?人单克隆抗体的生产过程和鼠的单抗一样,只是采用认得B细胞和人的瘤细胞.全人单克隆抗体不存在鼠源性异种蛋白的抗原性,不会被人体免疫系统攻击.直接可以用于医疗,很安全,而人源化的单抗则是制作出鼠的单抗后,利用基因操作手段,置换或者切除单抗基因中鼠源性的蛋白片断,弱化其在人体内的抗原性,达到疗效.（取得抗体效价高的小鼠外周血7. 关于小鼠骨髓瘤细胞用骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合后形成杂交瘤细胞,注射到小鼠体内,那么小鼠不会被骨髓瘤细胞毒害吗?骨髓瘤细胞不是病毒.骨髓瘤细胞是一种癌细胞,他对小鼠造成伤害就是通过不断增殖造成的.所以最后小鼠会腹水,这时候可以从腹水中提取单克隆抗体.小鼠最终会因为骨髓瘤细胞过度繁殖死亡.就和患癌症一样,但是小鼠在实验室中有很多,所以实验室还用这个办法制备单克隆抗体.8. 杂交瘤细胞在小鼠体内可以存活多久杂交瘤细胞是由骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成（单克隆抗体技术学了吧）,所以呢,他可以像肿瘤细胞一样无限增值,也可以像B细胞分泌抗体,于是他就会一直存活下去,等到小鼠死了,体内营养物质被消耗完了,癌细胞不能增值,又到了其自然寿命的时候（一般癌细胞我们不谈寿命,癌细胞9. 单克隆抗体对人体来说是不是抗原答：因为一种生物的抗体在另一种生物的体内也是一种外来蛋白比如说你选用的单克隆抗体是由小鼠来源的B淋巴细胞所分泌的那么这个单克隆抗体对于人体来说就是抗原，而对于小鼠来说就是抗体。
单抗中常见问题解析
1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？答：可以从这几个方面一一考虑：（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。
对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。
（2）免疫的周期不正确。
免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。
（3）免疫佐剂不合适。
TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。
（4）免疫剂量不合理。
过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。
一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。
（5）免疫途径不合理。
对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。
（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。
同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。
对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。
2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？答：可以从这几个方面考虑：（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。
免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。
（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。
（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。
单克隆抗体制备若干问题解答
单克隆抗体制备若干问题解答问题一：单克隆抗体与多克隆抗体有何区别？单克隆抗体：指抗体形成细胞克隆所产生的抗体，即由一个细胞的后代所产生的针对一种它能识别的抗原决定簇的的专一性抗体。
多克隆抗体：指抗原入侵机体（由于抗原物质可能包含多种分子，当然有时即便是只含有一种分子也是由多种抗原决定簇组成的），刺激具有相应抗原受体的不同淋巴细胞增殖分化，而产生的多种抗血清抗体。
可见单克隆抗体与多克隆抗体的主要区别在于其抗体种类是否单一，而不是抗体数量的多少。
问题二：单克隆抗体制备流程中的“两次筛选”是如何进行的？第一次筛选：（1）筛选对象：脾细胞、瘤细胞、脾-脾细胞、瘤-瘤细胞、脾-瘤细胞（即羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后得到的细胞混合液）。
另有少量多细胞聚体，因寿命短而迅速死亡，故无需特别筛选。
（2）筛选方法：用HAT选择培养基筛选出正常生长的细胞。
（注意：HAT培养基含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。
其中氨基喋呤能阻断核酸合成的主通路，而次黄嘌呤在磷酸核糖转移酶HGPRT的催化下能合成RNA或胸腺嘧啶核苷在胸腺嘧啶核苷激酶TK的催化下合成DNA均属于核酸合成的旁通路。
）（3）筛选结果：脾-瘤细胞正常生长，其它细胞都会死亡。
（析因：脾细胞和脾-脾细胞的核酸合成主通路被氨基喋呤阻断，虽有核酸合成的旁通路，但不能长期增殖；瘤细胞和瘤-瘤细胞缺乏核酸合成旁通路的酶，核酸合成主通路又被氨基喋呤阻断，因核酸合成障碍而死亡；脾-瘤细胞具有脾细胞的核酸合成旁通路酶，虽核酸合成主通路被氨基喋呤阻断，但可利用培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。
）第二次筛选：（1）筛选对象：多克隆杂交瘤细胞群体。
（即产生多种抗体的脾-瘤细胞混合群体。
）（2）筛选方法：抗体检测（如免疫荧光技术、放射免疫技术等，实际上是利用稀释法，在聚乙烯微板孔内逐个杂交瘤细胞分开培养，然后检查每孔中产生特定抗体的能力）。
高亲和力单克隆抗体制备问题及对策
高亲和力单克隆抗体制备问题及对策一、单抗制备-骨髓瘤细胞SP2/0培养过程中遇到的问题及对策1，细胞长的慢或细胞死亡正常生长情况下，细胞一天传代一次，生长越好，贴壁越多对策：①培养基配方不对；②接种密度太低，低于10的4次方；③污染了支原体或者其他不明细菌，支原体的现状是出现小黑点；细菌污染是浑浊；霉菌污染是出现白色肉眼可见菌落；不明细菌污染出现砂状平铺背景，视野发暗。
④细胞瓶刷洗不干净2，细胞形态异常正常生长情况下，细胞浑圆，透亮，成对数生长，生长越好，贴壁多，悬浮少对策：①培养基配方不对；②接种密度太低，低于10的4次方；③污染了支原体或者其他不明细菌，支原体的现状是出现小黑点；细菌污染是浑浊；霉菌污染是出现白色肉眼可见菌落；不明细菌污染出现砂状平铺背景，视野发暗。
④细胞瓶刷洗不干净二、单抗制备-细胞融合筛选过程中遇到的问题及对策1，融合率低，阳性孔少①免疫的问题。
由于免疫原性不强或者免疫途径不当造成免疫弱，效价低。
②融合过程中温度、时间、PEG分子量，作用时间等。
③脾细胞是否取出了足够多的细胞，有无组织碎片干扰。
④融合前骨髓瘤细胞生长状态是否完好，细胞是否浑圆，透亮，成对数生长。
2，单抗亲和力整体低①免疫的问题。
免疫途径不当或者免疫原问题。
②融合细胞筛选过程出现遗漏，筛选方法不当或检测方法不当，造成没有筛到高亲和力的融合细胞。
③由于亚克隆细胞生长环境不合适，导致融合细胞染色体丢失，分泌特性改变，亲和力从高变低，这时就需要及时更换培养液，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失；控制好细胞的密度，密度过大使新加入的培养基不至于很快被消耗，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失；不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。
操作细致，防止细胞被支原体等微生物污染。
3，抗体亲和力从高变低①没有及时更换培养液，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失或者性状改变。
单克隆抗体制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。
下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。
一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。
2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。
3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。
在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。
使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。
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单克隆抗体制备常见问题分析
一、免疫失败的可能原因及应采取的措施
有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。
1、免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。
2、抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。
3、制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
4、所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。
5、免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。
6、动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
二、制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。
其主要失败原因和影响因素有
1、污染
包括细菌、霉菌和支原体的污染。
这是杂交瘤工作中最辣手的问题。
一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。
支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。
在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。
对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
2、融合后杂交瘤不生长
在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素
（1）PEG有毒性或作用时间过长。
（2）牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。
（3）骨髓瘤细胞污染了支原体。
（4）HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
3、杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
（1）融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。
（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
（3）对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。
也可能发生染色体丢失。
Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
三要：
要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。
要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
要定期进行再克隆。
三不要：
不要让细胞“过度生长”。
因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。
不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。
不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
4、杂交瘤细胞难以克隆化
可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。
若是融合后的早期
克隆化，应在培养液加HT。
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