分子生物学实验方法与步骤
生物化学与基础分子生物学实验
生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。
本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。
第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。
一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。
常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。
本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。
其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。
破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。
2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。
常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。
本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。
其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。
凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。
3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。
本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。
反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。
二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。
常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。
本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。
其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。
2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。
分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。
实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。
根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。
生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。
根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。
核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。
核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。
其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。
酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。
酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。
电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。
PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。
PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。
PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。
扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。
蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。
常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。
总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。
通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学操作手册
分子生物学操作手册一、引言分子生物学是研究生物体分子结构、功能和相互作用的一门学科。
操作手册旨在提供分子生物学实验的详细步骤，并帮助读者准确、高效地进行实验操作。
本文将介绍PCR扩增、DNA电泳、亚克隆和蛋白质表达等实验步骤，并提供一些常用操作的技巧和注意事项。
二、PCR扩增PCR扩增是分子生物学实验中常用的技术，用于扩增特定区域的DNA片段。
以下是PCR扩增的基本步骤：1. 准备PCR反应体系：根据实验需要，配置PCR反应液，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs等。
2. 设定PCR程序：根据模板序列的长度和引物的特性，设定合适的PCR程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
3. PCR反应：将PCR反应体系置于热循环仪中，按照设定的程序进行PCR反应。
4. 结果分析：利用DNA电泳等技术，分析PCR反应产物的大小和纯度。
三、DNA电泳DNA电泳是一种常用的DNA分析技术，用于确定DNA片段的大小和纯度。
以下是DNA电泳的基本步骤：1. 制备琼脂糖凝胶：根据需要，配制适当浓度的琼脂糖凝胶，并倒入凝胶槽中，形成凝胶床。
2. 加载样品：将PCR扩增产物或其他DNA样品与DNA标记物混合，加入琼脂糖凝胶孔中。
3. 进行电泳：将凝胶槽放入电泳仪中，进行电泳操作，根据需要设置适当的电压和时间。
4. 结果分析：利用紫外线透射仪观察凝胶上DNA迁移的情况，测量DNA片段的大小。
四、亚克隆亚克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，通常用于构建重组DNA或进行基因克隆。
以下是亚克隆的基本步骤：1. 准备载体和DNA片段：准备含有目标基因的DNA片段和经酶切的载体DNA。
2. 消化与连接：将DNA片段与载体DNA进行连接反应，通常使用DNA连接酶。
3. 转化：将亚克隆反应产物转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等技术，鉴定含有目标基因的克隆。
五、蛋白质表达蛋白质表达是将目标蛋白质在细胞内大量合成的过程，利用该技术可以生产重组蛋白以供研究和应用。
分子生物学常用实验技术及方法
第二章 常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl ，其中含有：模板DNA 0.5 µlPCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl10×MgCl 2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl无菌去离子水加至 50 µl上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退火1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR 技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和DNA片段2；3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：片段1 1 µl片段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O至50 µl在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。
分子生物学实验步骤
细菌的活化及培养1.将实验室用到的烧杯、锥形瓶、培养皿等实验器皿用超声机超声20min，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗干净，放入烘箱中烘干。
按照培养基成分配置液体培养基，分别调好pH值后,然后进行灭菌30min。
牛肉膏蛋白胨培养基配方接种：在超净工作台中，取1 mL的菌种加入液体培养基中，混匀，37℃恒温振荡培养12h。
2.菌种的保存（采用甘油保藏法）先取800uL的菌悬液于1.5mL的无菌离心管中，再加入200uL的灭菌甘油，用封口膜将离心管口封号，以上操作均在超净工作台中完成，然后将装有甘油和菌悬液的混合液在漩涡震荡以上混匀，保存至-78℃。
细菌DNA的提取采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒对单增李斯特菌进行基因组DNA抽提。
操作步骤如下：1）取细菌培养液1ml，1000rpm离心一分钟，尽量吸净上清。
2）向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第二步，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μl缓冲液（110μl TE缓冲液,70μl溶菌酶），37℃处理30min以上。
3）向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
4）加入220μl缓冲液GB(改良磷酸盐缓冲液)，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。
如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。
5）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
分子生物学实验步骤总结超全
1)台式高速离心机2)恒温水浴箱3)枪式移液器4)灭菌的EP管和Tip头1)溶液1: 25% 蔗糖50mmol/L 50mmol/L 500ug/ml 100ug/ml Tris-Hcl，pH8.0 EDTA，pH8.0溶菌酶(现用现配) RNase2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.01% SDS400ug/ml 蛋白酶K3)酚：氯仿：异戊醇(25：24 ：1)4)氯仿：异戊醇(24：1)5) 3mol/L NaAc(pH5.2)6)异丙醇或者无水乙醇7) 70%乙醇8) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.01mmol/L EDTA ，pH8.01) 5mL细菌过夜培养， 5000rpm离心10分钟，去上清液。
2)将菌体细胞悬于250uL溶液1中， 37°C水浴保温过夜。
3)加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4)加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24 ：1)，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
5)向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6)向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇(或者2.5倍体积的无水乙醇)，冰上放置30分钟。
7) 14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。
8)将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。
9)进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1)研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠， 37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。
2) 10 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验
分子生物学实验引言分子生物学实验是研究生物体分子层面的结构和功能的实验方法。
通过在分子水平上研究细胞中的基因表达、蛋白质合成和代谢等过程，可以全面了解生物体的生理机制和疾病发生的分子基础。
本文将介绍常见的分子生物学实验方法和技术。
1. DNA提取实验DNA提取是分子生物学实验中的基础步骤，它的目的是从细胞中分离出DNA。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、CTAB法和商业试剂盒法等。
以下是酚/氯仿法的步骤：1.收集样本组织或细胞：可以使用动植物组织、细菌、真菌等样本。
2.细胞破碎：使用细胞破碎缓冲液将样本破碎，释放出内部的细胞和胞浆。
3.蛋白质沉淀：加入酚/氯仿缓冲液，使蛋白质从细胞裂解物中沉淀。
4.DNA沉淀：将上一步的上清液加入异丙醇中沉淀DNA。
5.洗涤和溶解：用乙醇洗涤并净化DNA沉淀，最后用缓冲液溶解DNA。
2. PCR实验PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中的一种重要技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR实验一般包括以下步骤：1.DNA模板准备：提取好的DNA作为PCR反应的模板。
2.反应组分配置：配置PCR反应体系，包括引物、脱氧核苷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等。
3.反应条件设定：设置PCR反应的温度和时间参数，包括变性、退火和延伸步骤。
4.PCR扩增反应：将PCR反应体系放入热循环仪中进行循环扩增。
5.PCR产物分析：使用凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析和检测。
3. 克隆实验克隆实验是将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化和筛选得到含有目标DNA的克隆。
以下是常见的克隆实验步骤：1.DNA片段选择：根据需要选择目标DNA片段，并通过酶切或PCR方法制备。
2.载体准备：选择适当的载体，如质粒或噬菌体，并进行酶切或PCR扩增。
3.构建重组体：将目标DNA片段和载体DNA连接，形成重组DNA。
4.细胞转化：将重组DNA引入宿主细胞中。
5.筛选克隆：通过筛选方法（如抗生素筛选）获得含有目标DNA的克隆。
分子生物学实验指导
《分子生物学》实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈，纯的RNA样品A260/280≈，并且1μg/ml DNA溶液A260=。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是研究生命体系分子结构、功能和相互作用的一门学科，它成为了现代生物学中极为重要的分支。
分子生物学技术主要包括DNA/RNA提取、PCR 技术、电泳技术、DNA Microarray技术、测序技术、基因编辑技术等。
本文将重点介绍分子生物学常用的实验技术。
一、DNA/RNA提取DNA/RNA提取是分子生物学实验中最基础的步骤，其目的是从样本中分离出DNA/RNA，为后续的实验提供物质基础。
常用的DNA/RNA提取方法包括酚-氯仿法、硅胶膜法、离心柱法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的一种方法。
该方法操作简单，成本低，适用于大多数的样本。
二、PCR技术PCR技术是分子生物学实验中最具代表性的技术之一，它能够在体外合成大量特定序列的DNA分子。
PCR技术的关键是引物设计，引物的选择和设计直接影响PCR反应的特异性和灵敏度。
同时，PCR反应中的缩合酶也是至关重要的因素，它能够在合适的温度下将引物特异性地结合，并引导DNA合成。
近年来，PCR技术已经广泛应用于极为多样化的领域，包括基因检测、疾病诊断、脱氧核糖核酸序列确定等。
三、电泳技术电泳技术是分子生物学实验中使用较多的技术之一，它能够分离不同长度的DNA或RNA分子，从而确定它们的大小和数量。
电泳技术的操作步骤相对简单，但是不同的电泳仪和所用电极对其结果的影响巨大。
同时，电泳结果也需要进行染色、成像、定量和分析，以确定它们在实验中的作用。
四、DNA Microarray技术DNA Microarray技术是一种高通量、并行性大的遗传学方法，它能够测定大量DNA样本之间的差异。
这种技术直接基于互补杂交的原理，利用DNA序列之间的配对反应来评估不同的DNA样本之间的差异。
DNA Microarray技术已被广泛应用于癌症和复杂人类疾病的诊断、药物研究和基因表达分析等领域。
五、DNA测序技术DNA测序技术是分子生物学实验中最具有代表性和标志性的技术之一，采用这种技术能够准确和高通量的测定DNA序列。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导1. 实验背景分子生物学是研究生物大分子的结构、功能和相互作用的一门科学。
它包括DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的研究，以及研究它们在细胞内的功能和相互作用的方式。
分子生物学的发展对于理解生物现象、治疗疾病和推动基因工程等都起到了重要的作用。
在进行分子生物学实验之前，我们需要了解一些基本的实验原理和步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍一系列分子生物学实验的指导，包括DNA提取、PCR、凝胶电泳等。
2. 实验材料•细菌培养基•细菌菌株•试剂盒（DNA提取、PCR、凝胶电泳）•离心管、PCR管、琼脂糖凝胶板等实验器材3. 实验步骤3.1 DNA提取1.取一定数量的细菌菌株，并将其转接到细菌培养基中。
2.在转接后的细菌培养基中培养一夜，使细菌得到充分生长。
3.将培养好的细菌菌液转移到离心管中，进行离心。
4.移除上清液，加入细菌细胞裂解液，并进行充分混合。
5.进行高速离心，将裂解后的细菌细胞碎片与上清液分离。
6.取得上清液，为DNA提取做好准备。
3.2 PCR1.准备PCR反应试剂盒，包括模板DNA、引物、dNTPs等。
2.处理PCR管，加载模板DNA、引物、dNTPs和酶。
3.设置PCR反应器的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
4.将PCR反应管放入PCR机中，进行PCR反应。
3.3 凝胶电泳1.准备琼脂糖凝胶板，根据需要调整琼脂糖浓度和凝胶浓度。
2.准备样本，将PCR反应产物与DNA标准样品一同加载到凝胶孔中。
3.加载电泳缓冲液，确保凝胶完全被浸泡。
4.打开电泳仪，进行凝胶电泳，设定一定的电流和时间。
4. 结果分析通过实验，我们可以获得一系列结果。
在DNA提取实验中，我们可以通过测量DNA的浓度和质量来评估提取的效果。
在PCR实验中，可以通过检测PCR产物的大小和数量来评估PCR反应的效果。
在凝胶电泳实验中，可以通过观察凝胶图像来判断PCR产物的大小和纯度。
5. 实验注意事项在进行分子生物学实验时，需要注意以下事项：•实验前要充分准备。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理及目的1. 实验原理：介绍PCR（聚合酶链反应）的原理及应用。
解释DNA提取、扩增和测序的基本步骤。
说明基因克隆、表达和纯化的过程。
2. 实验目的：让学生掌握PCR技术的操作步骤和技巧。
培养学生对DNA提取、扩增和测序的基本能力。
培养学生进行基因克隆、表达和纯化的实验技能。
二、实验材料及试剂1. 实验材料：学生分组，每组一份实验材料套装，包括DNA模板、引物、酶、dNTPs等。
2. 实验试剂：PCR反应混合物（含PCR缓冲液、酶、引物、dNTPs）DNA提取试剂盒琼脂糖凝胶核酸染料电泳缓冲液转移缓冲液洗涤缓冲液三、实验步骤及注意事项1. 实验步骤：按照实验材料及试剂的准备要求，准备实验所需的材料和试剂。
按照实验原理，进行PCR反应、DNA提取、扩增和测序等实验操作。
观察并记录实验结果，进行数据分析和解释。
2. 注意事项：实验操作过程中要严格遵守实验室安全规定，佩戴好个人防护装备。
在进行PCR反应时，要准确控制温度和时间，避免非特异性扩增。
在操作DNA时，要避免核酸的降解和污染。
四、实验结果与分析1. 实验结果：观察PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳结果，记录DNA条带的大小和亮度。
分析DNA提取、扩增和测序的结果，确定目标基因的存在和序列。
2. 结果分析：根据实验结果，分析实验操作的准确性和可行性。
比较不同实验条件下的结果，探讨实验条件的优化方法。
结合理论知识，解释实验结果的生物学意义。
1. 实验报告内容：实验目的、原理和步骤的概述。
实验材料和试剂的使用情况。
实验结果的描述和数据记录。
实验结果分析的结论和讨论。
报告要条理清晰，语言简练，数据准确。
结果图要清晰，图例说明详细。
报告要包括实验操作中的问题和解决方法。
报告要结合实验结果，提出实验现象的解释和相关问题的讨论。
六、实验技能与技巧训练1. 实验技能：培训学生进行PCR反应的技巧，包括DNA模板的制备、引物的设计、反应混合物的配置等。
分子生物学实验 实验步骤 李明
5. 分别将两组反应液各转移到新的1.5ml离心管中，加入200ul的LB培养基，37℃复苏培养1小时。
（四）转化子的培养和筛选
1．取复苏菌液100ul，直接涂布于培养基上
2．转化实验组涂布含有Amp的LB培养基上；空白对照组涂布于含有Amp的LB培养基上和不含Amp的LB培养基上。
实验四 PCR技术及产物鉴定
实验步骤
配置PCR反应液于PCR管中
反应液加毕, 混匀，最后瞬时离心把反应液全部集中于PCR管底部。
２.PCR反应：按以下条件进行PCR反应
3.电泳（鉴定）
反应结束后，取3μl反应液，加入少量Loading buffer混匀，进行1％的琼脂糖凝胶电泳（150V）。（Marker由老师操作）。
3.小心吸去上清，加0.7ml培养基通过吹吸悬浮细胞，然后铺到3.5ml培养皿中（预先加入2ml培养基），摇匀；
4.镜检，观察细胞数量和形态；
5.27℃，2-3天后准备用来提取DNA；
实验二动物细胞DNA的提取
操作步骤
１.细胞的收集
（1）将细胞吹起,转入离心管(细胞数量少的补加100-200ul细胞悬液)。 1500g（4000rpm）离心5min,弃上清。
实验六感受态细胞的制备
1．37℃培养菌体约至OD600为0.3-0.4。
2．在洁净台上，每人取培养液一个1.5ml转入1.5ml离心管中，在冰上冷却10min,于4℃，4000rpm/min离心5min.
3.倒掉上清培养液，用750ul的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10min. 于4℃，4000rpm/min离心5min.
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制：ddH2O 1.4 ml30%储备胶 0.33 ml1M Tris-HCl 0.25 ml10%SDS 0.02 ml10%AP 0.02 mlTEMED 2 μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。
（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三）电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。
（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。
（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。
室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。
现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。
必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。
正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。
所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。
目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。
可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit1．T7·Tag抗体琼脂。
2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
1. PEG 20000。
（二）操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。
包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V,4M脲素。
4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。
将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
表达蛋白的生物学活性的检测一、MTT比色法检测细胞活性（一）原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。
对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中, 抽滤除菌。
2、 L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、 MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、 SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、 L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、 L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、 37℃ 5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。