蛋白质的分离与纯化

水分 血浆
血红蛋白
血
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
血红蛋白的特点：
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。
血红蛋白
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团
一、血红蛋白的提取和分离
1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物 理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种 类的蛋白质。
吸出上层透明的
，将下层
的红细胞液体倒
入
中再加入用
的 质量分数为0.9％的
氯化钠溶液洗涤
⑤ 低速离心（低速短时间）
⑥ 重复4、5步骤
次，直至上清液中已没有
，
表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数
过少。
(2) 血红蛋白的释放
加
到
体积，再加40％体积的
（ 溶解细胞膜） ，置于
上充分搅拌10分钟
源自文库
（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.
(3) 分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以
2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:
第1层（最上层）：
甲苯层
第2层（中上层）：
的沉淀层， 色薄层固体
第3层（中下层）：
的水溶液层，
的液体
第4层（最下层）：其它杂质
的沉淀层
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
的蛋白质被滞留；
的蛋白质被向下移动。
（4）
不同的蛋白质分子完全分开；
（5）
的蛋白质行程较短，已从
中洗脱出来， 的蛋
白质还在行进中。
（二） 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加
稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓
冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、 作用：能够抵制
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）
加入待分离的样品
使分子迁移速度不同 阳极
分子向阳极移动
缓冲液
凝胶电泳原理示意图
二． 实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
1. 样品处理
(1) 红细胞的洗涤
① 目的：去除
② 方法：
离心（速度越高和时间越长会使白细胞
和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
。SDS能使
蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条
肽链，因此测定的结果只是
。
SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质
分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决
于
。
带电性质、分子大小和形状的不同，
凹穴底面。
c、剪尼龙网小圆片覆盖在
上，用 的尼龙纱将橡皮
塞 包好，插到玻璃管一端。
d、色谱柱下端用移液头部做
，连接一细的 ，并用
螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集
的收集器内
③ 顶塞的制作：
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④ 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤ 安装其他附属结构。
2）凝胶色谱柱填料的处理
⑤ 收集：待
接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每
收
集一试管连续收集
1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的 红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行
DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血 红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
2.提问：血液有哪些成分？
【识记】
（一）凝胶色谱法（分配色谱法）
1、概念：根据被分离蛋白质的
，利用具有网
状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。
2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对
的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速
度
，而
的蛋白质无法进入凝胶内
部的通道，只能在
移动，路程
，移动速
度
，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分
12小时。
3）样品加入与洗脱
（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的
缓慢下降到
与
平齐，关闭出口
（2）加透析样品
① 调整缓冲液面：与凝胶面平齐
② 滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的
③ 样品渗入凝胶床：
④ 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
的对溶液的
的影
响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制
通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的
就可以制得
使用的缓冲液。
（三）电泳：
1、 概念：指
发生迁移的过程。
2、原理：许多重要的生物大分子，如
等都具有
在 下，这些基团会带上
。在电场的作用下，这些带
电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的