循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞C T C检测及

临床应用

Prepared on 22 November 2020

循环肿瘤细胞检测及临床应用

中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。

关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床

Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌，、前列腺癌，、结直肠癌等。

基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。

CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。

1CTCs富集技术

为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型。

CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。

1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

以免疫亲和性为基础的CTCs富集主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs靶抗原(如EpCAM)之间的高度特异性。基于EpCAM抗体的富集技术有很多种，主要区别在于捕获的方法有所不同。抗体捕获的方法主要有以下几种。

(Magneticbeads)

免疫磁珠法富集CTCs主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs抗原(如EpCAM)之间的高度特异性反应，免疫作用促使抗原与耦合到磁珠的抗体发生特异性的结合，然后抗原-抗体复合物被置于磁场作用之下，通过磁场对磁珠固定从而使CTCs与其他血液细胞分离，产生富集效果。

CellSearch系统是免疫磁珠方法应用的典型代表。在该方法中，经过密度梯度离心富集的外周血被收集到含有防凝剂的收集管中，然后被放置到一个自动化的制备系统。该系统利用免疫磁珠富集EpCAM阳性的细胞。捕获效率主要与EpCAM的表达水平有关。有研究表明在EpCAM高表达的细胞中，有大约75%的捕获效率，而在EpCAM低表达的细胞中，大概只有42%的表达捕获效率。在检测的过程中，富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。标记的细胞被CellTrackAnalyzer计数和分析，最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性。

磁铁清扫装置(magneticsweeperdevice)是新开发出来的技术，磁铁清扫装置提高被磁珠包被的EpCAM抗体的捕获能力。这种技术的可以达到62%的捕获效率，51%的纯度，9ml/L的通量。用这种磁珠清扫设备用RT-PCR的方法从30个转移性乳腺癌病人中的21个病人的血液中检测出了CTCs。

磁性筛装置(magneticsifterdevice)，通过微阵列的形式在磁场孔边缘产生极高的磁性区域，在富集过程中使用垂直流动构造，可以增强捕获效率到%，提高了处理速度，最优达到10ml/h。

AdnaTest(AdnagenAG，Langenhagen，Germany)是一个商业化的设备，它采用了磁珠与各种癌症(如乳腺癌，直结肠癌，前列腺癌，卵巢癌)的特异性抗体进行鸡尾酒式结合，并用多重RT-PCR的方式检测CTCs，这套实验装置已经真是可用于转移性乳腺癌，卵巢癌。比较研究发现，AdnaTestbreastcancer装置从55个转移性乳腺癌病人中的29个病人血液中检测出了CTCs，而CellSearch装置只从26个检测出了CTCs。

Fig1CellSearch富集检测CTCs流程

是一种基于免疫亲和以及芯片的CTCs检测技术，在970mm2的表面上，排列了78000个被EpCAM抗体包被的硅微柱，用于捕获CTCs。通过抽气产生压力使血液样品以1-2ml/h的速度不间断的从芯片表面通过。这种缓慢的流速可以保证CTCs吸附在EpCAM包被的微处理器上。而这种硅微柱提供了大量的表面积用于接触，从而使EpCAM表达高或者低的CTCs的捕获效率差别不大，捕获效率超过60%，纯度大约50%。用癌症患者和健康人体的血液样品经过CTCs-chip检测，从116个患者中的115个患者身上检测到了CTCs，而20个健康人体没有检测到CTCs，敏感性达到了%，特异性为100%。同时，检测到的CTCs数目与病人的病情相关。