常见病原菌分离方法
常见病原菌采样分离过程
金黄色葡萄球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）奶样的采集：采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。
（2）乳房皮肤拭子用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。
拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
（3）鼻腔拭子用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
菌种的初步分离首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35℃培养18小时左右。
需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。
2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
肠球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
植物病原菌分离方法
➢ 培养性状的描述，要注明培养基的 种类、培养温度和有无光照等。
真菌培养性状的观察，最好多用几种 培养基。
✓ 如 镰 刀 霉 属 (Fusarium ) 和 青 霉 属 （Penicillium）等，在各种培养基上 的培养性状在鉴定上是很重要的。
✓ 链孢菌属（Alternaria） ✓ 小丛壳属（Glomerelia） ✓ 茎点菌属（Phoma） ✓ 拟茎点菌属（Phomopsis） ✓ 曲霉
特殊类型真菌的分离 采用特殊的方法分离
特殊的培养基；如
集孢粘菌：（Acraciomycetes） 以E.coli为食
专性寄主的用诱饵分离
采用特殊的培养条件
细菌的排除
➢ 将培养基调节至酸性环境，10ml培 养基中加3滴25％的乳酸
➢ 加孟加拉红，配培养基时加入 35mg/L
➢ 加抗生素，除氯霉素外，其余均灭 菌后加入
金霉素：抑制多数细菌（30ug/ml） 青霉素：抑制G+细菌，20ug/ml 多粒霉素B：抑制G-细菌（5ug/ml） 链霉素：40ug/ml 氯霉素：50ug/ml，大部分细菌
现几种不同形状的菌落，终有 1种是主要的。 如果菌落类型很多，且不分主 次，很可能未分离到病原细 菌，应考虑重新分离。 如果不熟悉1种细菌菌落的性 状，就应选择几种不同类型的 菌落，分别培养以后接种测定 其致病性，最终确定病原细 菌。
一种细菌病害一般是由一种 病原细菌引起的，琼胶平板上 出现几种不同类型的菌落，实 质上只有一种是真正的病原
板，但难于掌握温度，也可平 板涂布。
组织分离法（真菌）
➢ 切取小块病健交界处的病组 织，经表面消毒和灭菌水洗过 以后，移在琼胶培养基平板上 培养，待真菌长出后挑取菌丝 进行纯化，得到植物病原真菌 的分离方法。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
猪链球菌的分离与鉴定
猪链球菌的分离与鉴定
猪链球菌（Streptococcus suis）是引起猪链球菌病的病原菌，能感染猪只，特别是幼猪。
下面是猪链球菌的分离和鉴定方法：
1. 分离：
- 从疑似患有猪链球菌病的猪只或组织样品中采集样品。
- 将样品接种到适宜的富营养培养基上，如含有血液的琼脂平板或在琼脂深培养基上。
- 在适当的条件下培养，如在37°C下孵育一夜。
- 观察培养基上的生长情况，猪链球菌通常呈灰白色圆形菌落。
2. 纯化：
- 选取疑似猪链球菌的单个菌落，用无菌线形勺或钝尖的无菌环划取。
- 将菌落转移到含有猪链球菌病人血清的琼脂平板上，进行纯化。
- 用琼脂深培养基进行进一步的纯化。
3. 形态和生理鉴定：
- 使用显微镜观察猪链球菌的形态特征，如形状、大小和排列方式。
- 进行革兰染色，猪链球菌显示革兰阳性，表现为圆形或椭圆形细胞。
- 进行氧需要实验，猪链球菌为厌氧菌，不需要氧气进行生长。
- 进行糖发酵试验，猪链球菌通常能产生酸和气体。
4. 生化鉴定：
- 进行羟吲哚试验，猪链球菌通常产生羟吲哚。
- 进行尿素酶试验，猪链球菌通常不产生尿素酶。
- 进行乳糖巴氏杆菌液功效和TM产品试验，猪链球菌通常不能生长。
5. 分子鉴定：
- 使用PCR技术进行特异性扩增，引物可以选择猪链球菌特异性基因，如16S rRNA基因等。
- 进行凝胶电泳分析，观察PCR产物的大小和特异性。
通过以上步骤的分离和鉴定，可以确认是否存在猪链球菌，并确保纯化的菌株为猪链球菌，以便进一步研究和处理。
病原菌分离培养总结
病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量抱子的病原真菌的分离。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
二 .病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1.分离的准备工作（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。
背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。
（2）培养基的准备：PDA培养基，加热熔化，紫外灭菌后倒板；（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲（针）、70%酒精、0. 1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。
2.组织分离法（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70%酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶（或其他分离材料），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块病组织数块。
（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。
腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
）(4)表面消毒：用菌培养皿一次准备流程(75%酒精一0.1%升汞一无菌水—无菌水一无菌水)，将病组织放人70%酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0. 1%升汞液中分别表面消毒1 min左右(如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些)，然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
常见病原菌分离方法
常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。
，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。
材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。
如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。
分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。
振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。
直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
菌落分离纯化的方法
菌落分离纯化的方法
菌落分离纯化是微生物学中常用的一种方法，用于从混合培养基中分离出纯种细菌。
以下是一些常见的菌落分离纯化方法：
1. 灭菌分液法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后在形成的菌落中选择单个菌落，用接种环在无菌条件下转移到新的琼脂平板上，经过培养后得到纯种菌落。
2. 稀释分液法，将混合培养基连续稀释后，在琼脂平板上均匀涂布，使得每个菌落都来自于单个细胞，然后进行培养，最终得到纯种菌落。
3. 过筛法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后用无菌玻璃珠滚动在菌落上，使得每个菌落只有一个细胞，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。
4. 挑拣法，在混合培养基上直接挑选出单个菌落，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。
这些方法都可以用于分离纯化菌落，选择合适的方法取决于具
体的实验要求和操作技能。
值得注意的是，在进行菌落分离纯化时，需要严格遵守无菌操作规范，以避免外源微生物的污染。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验[技巧]
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植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
植物病原菌分离方法
细菌、酵母、产孢多真菌纯化
➢ 优点：操作简便 ➢ 缺点：不能看到和不能一个菌落是从单孢繁殖而来，纯化可靠性差。
应用范围：细菌、酵母、产孢多真菌等细胞较大的植物病原菌纯化
稀释纯化法
➢ 将孢子（细胞）悬浮液中加适量灭菌水→不断稀释再一小滴悬浮液→ 镜检→只有一个孢子的悬浮液→移植
平板表面单孢分离法：取法 玻璃毛细管分离法 单孢子分离法 显微操作仪分离法
➢ 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒
效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒
➢ ⑵漂白粉
常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子
成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。 最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙 好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。 一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。处理种子5－10min，
七、真菌的培养性状
植物病害方面，培养真菌的目的主要是观察它的性状和研究环境条件对它的影 响，或者是大量繁殖后用于接种或其他试验。
培养的方法是将纯化的菌种，根据试验的要求，移植在适当的固体或液体培养 基上培养，后者可以静止或振荡培养。
➢ 固体培养 ➢ 液体培养
静→动
培养性状的观察
➢ 观察和记载的项目主要是：
➢ 贴标签
分离材料和日期等
➢ 培养及结果观察
挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。
若分离成功，琼胶平板上菌落形状和大小比较一致，即使出现几种不同形状的 菌落，终有1种是主要的。
如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离。 如果不熟悉1种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养以
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
简述植物病原真菌组织分离法和稀释(孢子)分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释
简述植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释1.引言植物病原真菌是引起农作物疾病的主要病原体之一，研究植物病原真菌的组织分离方法和稀释（孢子）分离方法对于疾病的诊断和防治具有重要意义。
植物病原真菌组织分离法是通过从感染植物组织中分离出纯种的真菌菌落，从而研究其特性和致病机制。
稀释（孢子）分离法则是通过将真菌孢子稀释到一定浓度后分离，利用分离得到的孢子进行研究和防治。
本文将对这两种方法的适用材料、优点和缺点进行简述和总结，以期为植物病原真菌研究提供参考。
）分离法的缺点":{}}}}请编写文章1.1 概述部分的内容1.2文章结构文章结构是指文章的整体架构和组织方式，帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。
本文主要介绍植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点。
具体的文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 植物病原真菌组织分离法2.1.1 适用材料2.1.2 优点2.1.3 缺点2.2 稀释（孢子）分离法2.2.1 适用材料2.2.2 优点2.2.3 缺点3. 结论3.1 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料3.2 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的优点3.3 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的缺点在文章结构中，逐步展开对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的介绍，包括适用材料、优点和缺点等方面的内容。
最后通过结论对两种方法进行总结和概括，使读者对这两种方法有个整体的认识。
1.3 目的本文的目的是对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点进行简要描述和分析。
通过介绍这两种常用的真菌分离方法，旨在帮助读者更好地了解和选择适合的实验方法，提高病原真菌的分离效率。
具体而言，我们将详细介绍植物病原真菌组织分离法的适用材料，包括所需的培养基、植物组织、分离介质等。
病原体分离与鉴定实验技术
病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定1. 样本采集与处理首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定1. 细胞培养法病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进行病毒的鉴定。
3. 血清学检测病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定1. 样本采集与处理对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
病原菌的分离鉴定
竭诚为您提供优质文档/双击可除病原菌的分离鉴定篇一：常见病原菌采样分离过程金黄色葡萄球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）奶样的采集：采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。
（2）乳房皮肤拭子用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。
拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
（3）鼻腔拭子用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
菌种的初步分离首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。
需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。
2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
肠球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
怎样进行病原菌的分离
如何进行病原菌的分离、纯培养材料用具菌种：米曲酶 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球 白地霉 蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus）酿酒酵母产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基查氏琼脂培养基庖肉培养基肉汤培养基马铃薯培养基麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。
仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。
微生物的分离与纯化：一、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有1.简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。
有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。
6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。
(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。
二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。
为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。
植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。
最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。
病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。
（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。
(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。
(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。
(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。
（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。
(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。
植物病原菌的分离培养
植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离A:分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。
将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。
2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。
再次使用时必须重复灭菌。
培养皿、试验等要经过干热灭菌。
培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料B、植物病原菌的分离1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。
病原菌分离实验报告
病原菌分离实验报告一、实验目的本次实验旨在从临床样本中分离和鉴定病原菌，为疾病的诊断和治疗提供准确的病原学依据。
通过实验，掌握病原菌分离的基本方法和技术，熟悉常见病原菌的形态特征和培养特性。
二、实验材料1、临床样本：包括血液、尿液、痰液、粪便等。
2、培养基：血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板等。
3、试剂：革兰氏染色液、氧化酶试剂、触酶试剂等。
4、仪器设备：显微镜、培养箱、接种环、酒精灯等。
三、实验方法1、样本采集与处理血液样本：采集患者静脉血，注入血培养瓶中，立即送实验室进行培养。
尿液样本：收集中段尿，离心后取沉淀进行培养。
痰液样本：患者清晨深部咳痰，经生理盐水洗涤后，制成均匀的混悬液进行培养。
粪便样本：挑取脓血或黏液部分，制成混悬液进行培养。
2、接种培养用接种环取处理后的样本，分别划线接种于不同的培养基上。
将接种后的培养基放入 35℃培养箱中培养 18 24 小时。
3、观察菌落形态培养结束后，观察培养基上菌落的形态、大小、颜色、边缘、质地等特征。
4、涂片染色镜检挑取可疑菌落，制作涂片，进行革兰氏染色。
在显微镜下观察细菌的形态、排列方式等。
5、生化鉴定根据细菌的染色结果和形态特征，选择相应的生化试验进行鉴定。
如氧化酶试验、触酶试验、糖发酵试验等。
四、实验结果1、血液样本培养结果：在血琼脂平板上生长出圆形、凸起、表面光滑、湿润的菌落，有溶血现象。
染色镜检：革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
生化鉴定：触酶阳性，能发酵葡萄糖、麦芽糖，初步鉴定为金黄色葡萄球菌。
2、尿液样本培养结果：在麦康凯琼脂平板上生长出粉红色、光滑、湿润的菌落。
染色镜检：革兰氏阴性杆菌，短杆菌。
生化鉴定：氧化酶阴性，能发酵乳糖，初步鉴定为大肠埃希菌。
3、痰液样本培养结果：在血琼脂平板上生长出扁平、干燥、表面粗糙的菌落。
染色镜检：革兰氏阳性杆菌，有分枝。
生化鉴定：触酶阴性，能分解尿素，初步鉴定为结核分枝杆菌。
4、粪便样本培养结果：在麦康凯琼脂平板上生长出无色、半透明、圆形的菌落。
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常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。
，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。
材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。
如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。
分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。
振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。
直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
(2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。
(3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。
(4) 玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularia lunata)。
2．培养基PDA斜面培养基、水琼脂培养基。
3．仪器与用品超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70％酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝锅等。
四、实验操作(一) 利用震落法进行单孢分离(1) 用无菌操作将熔化后冷却到60～70℃的水琼脂培养基约10 ml倒入灭菌培养皿内，凝固成平板备用。
(2) 按无菌操作要领，将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30～45°角度，将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好，以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动，使孢子稀疏地落到平板表面，振落时宁轻勿重，以防过多孢子落于水琼脂平板表面。
提示：振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。
(3) 将水琼脂平板翻转后置于显微镜载物台上，用低倍镜(10×10)寻找平板表面上的单个孢子。
找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上，点涂一个圆点作为标志。
提示：可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后，待多数孢子开始萌发时再进行检查，这时较易观察，且可以保证孢子具有萌发和生长能力。
(4) 将水琼脂平板从载物台上取下，按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上，用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌，再置于25℃恒温箱培养。
(5) 数日后如果斜面培养基上生出菌丝，并形成孢子，经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的，则此菌种即是经单孢分离获得的纯菌株。
(二) 利用稀释法进行单孢分离(1) 用灭菌水配制孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液中有20～30个左右孢子时，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25％乳酸1～2滴)。
(2) 将已熔化好并冷却到45～50℃的水琼脂培养基约10 ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。
则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。
(3) 以振落法相同步骤操作，即可获得单孢系菌种。
(三) 利用直接挑取法进行单孢分离(1)、挑孢针的制作。
把直径为3～4 mm，长约15 cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔，将一个4号昆虫针尾部插入，把针尖部2 mm左右弯折90°而成。
提示：用金属材料制作的挑孢针灭菌容易，不易碰碎，可以长期使用。
(2) 把玉米大斑病病叶置于解剖镜下，寻找目标孢子。
可以先在低放大倍率(1×10)下寻找，在高放大倍率(4×10)下，观察是否为单个孢子。
(3) 找到分生孢子后，将挑孢针在酒精灯上高温灭菌，待稍冷却，用挑孢针把孢子粘上，在酒精等火焰上方移入试管斜面培养基上。
25培养3～5 d后，观察是否长出纯菌落。
提示：挑孢针在挑取孢子时如果不易黏取，可以先将挑孢针在培养基上轻轻划一下，增加黏性；如果在病叶上目标真菌孢子大量成堆，或周围有其他杂菌的孢子不易分开时，可以取一个干净的载玻片，用挑孢针挑取一些孢子，在载玻片上轻轻碰击，使孢子互相散开，然后在解剖镜下寻找单个孢子，挑取分离。
如果进行专性寄生菌的单孢分离，用挑孢针把孢子放在其寄主植物上即可获得单孢菌系。
五、实验作业上交分离得到的单孢系菌种。
六、思考题1．如采用在水琼脂平板上用孢子悬液划线后再寻找单孢的方法能否进行；单孢分离?2．设想还可以采用什么样的方法进行真菌的单孢分离?3. 用组织法分离长出菌落后，如果多个菌落混杂在一起如何进行进一步的分离纯化?4. 想一想直接挑取法除了进行单孢分离外还有其他什么用途?5．单孢子分离技术有哪些优点?附录3 真菌和细菌的菌种保藏病原生物纯培养的保存和贮藏技术是比较复杂而十分重要的。
在实际研究工作中，经常需要将保存的菌种与一些已知的或已鉴定过的标准菌种对比。
而被研究的分离物，一旦鉴定结束，也应妥善保存和贮藏，以便今后进一步研究和对比之用。
菌种纯培养的保存和贮藏中最重要的是如何保存这众多的分离物，使之不会因贮藏条件不妥而死亡，不因保存方法不当而发生变异，不被其他生物污染，能长期保存其生命力和原有性状不变。
为达此目标，通常都采用部分抑制或完全抑制病原生物的生长和代谢活动的方式以延长其存活期，并减少变异。
常用保藏方法有：1．室温保存许多真菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温(10～15℃)条件下，放在玻璃橱内即可。
对于鞭毛菌亚门的真菌，只适宜用这种方法保存，但每隔2～3个月，就要移植一次。
为了防止真菌在培养保存过程中致病力的退化和变异(如失去致病力，菌丝体变为黏液状，或失去产孢能力等)，常使用天然培养基，尽量减少糖的用量，有的直接放在灭菌的土壤中保存。
室温保存的优点是简便易行，无需特殊设备，缺点是培养基易干燥，每1～3个月需要移植一次。
2．低温保存将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包好，移至2～8℃的冰箱中保藏，是最常用的保存菌种的方法。
保藏时间依微生物的种类而有不同。
真菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移植一次。
酵母菌两个月，细菌最好每月移植一次。
此法为实验室和工厂菌种室常用，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备。
缺点是容易变异。
因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，致使微生物的代谢改变而影响了微生物的性状，并且需要屡次传代。
若菌种经常使用，而条件不变，宜应用此法。
如能放在-20℃或-60℃冰箱中或液氮罐中，则存活期可以更长。
但是放在-20℃或-60℃冰箱中的材料，尤其是放在液氮中的培养物外面必须密封，以防冻裂或破损。
3．石蜡油保存利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，其油面高度应超过斜面顶部lcm，以隔绝斜面上菌种与空气接触，使之处于无氧条件下，以抑制菌种的生长与代谢活动，而培养基也不会干燥。
这是许多真菌菌种的保存方法，效果好(一般可保藏2年以上不死)而成本低。
无芽孢的细菌也可保存一年左右。
加入石蜡油的菌种管可以放在室温下，也可放在冰箱中。
当重新需要菌种时，只要用接种钩从油面下钩取小块菌体重新放在斜面或平板上即可恢复生长。
此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移植。
缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。
4．灭菌蒸馏水悬浮保存土壤浸液和蒸馏水，经过灭菌以后，把细菌菌苔悬浮到这些液体中，密封后保存在冰箱中，其存活期可长达10年，是很理想而简易的保存方法。
几乎所有的真菌均可采用蒸馏水保存法，即把子板上生长的菌丝切成小块，连同培养基一起放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后放在室温下即可长期保存。
是目前最理想的保存方法。
5．干燥保存许多菌种在干燥后就会死亡，但真菌的菌丝体和孢子，有芽孢的细菌等，经适当的干燥后可以长期存活。
常用的干燥保存法是使用灭菌。
速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。
这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。
(1) 以无菌的脱脂牛奶(作为保护剂，使蛋白质不致变性)将微生物制成细胞悬液，加入长颈球形底的小玻璃管内，此管又称安瓿。
(2) 将安瓿放在低温下冷冻。
冷冻剂为干冰(固体二氧化碳)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃，将安瓿插入冷冻剂，只需冷冻4～5 min。
(3) 准备冷冻槽。
槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。
(4) 安瓿放入冷冻槽中的干燥瓶内。
(5) 抽气一般若在30min内，能达到102.67 Pa真空度时，则干燥物不致溶化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.66 Pa，保持压力6～8 h即可。
(6) 封口。
抽真空干燥后，取出安瓿，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约l0min(即可达到26.66 Pa)，以在真空状态下封口。
拟煤气喷灯的细火焰在安瓿颈中央进行封口。
密封的安瓿管可盛放在冰箱中。
(7) 菌种的恢复生长。
将安瓿管顶部用酒精消毒后，在火焰上加热，然后加一滴灭菌水使玻璃管炸裂，再向管中加入0.2 ml的灭菌水或蛋白胨水，静置数分钟后，摇匀成悬浮液，吸出放在培养基平板上。
置温箱中适温下便可恢复生长。
此法为菌种保存方法中最有效的方法。
对一般生活力强的微生物或其孢子以及无芽孢细菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。
但设备和操作都比较复杂，适用于菌种长期保存。