常见病原菌分离方法

常用的几种典型的病原菌分离方法

1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术

一、目的要求

了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理

单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器

1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)

(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

(2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。

(3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。

(4) 玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularia lunata)。

2．培养基PDA斜面培养基、水琼脂培养基。

3．仪器与用品超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70％酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝锅等。

四、实验操作

(一) 利用震落法进行单孢分离

(1) 用无菌操作将熔化后冷却到60～70℃的水琼脂培养基约10 ml倒入灭菌培养皿内，凝固成平板备用。

(2) 按无菌操作要领，将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30～45°角度，将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好，以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动，使孢子稀疏地落到平板表面，振落时宁轻勿重，以防过多孢子落于水琼脂平板表面。

提示：振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。

(3) 将水琼脂平板翻转后置于显微镜载物台上，用低倍镜(10×10)寻找平板表面上的单个孢子。找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上，点涂一个圆点作为标志。

提示：可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后，待多数孢子开始萌发时再进行检查，这时较易观察，且可以保证孢子具有萌发和生长能力。

(4) 将水琼脂平板从载物台上取下，按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上，用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌，再置于25℃恒温箱培养。

(5) 数日后如果斜面培养基上生出菌丝，并形成孢子，经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的，则此菌种即是经单孢分离获得的纯菌株。

(二) 利用稀释法进行单孢分离

(1) 用灭菌水配制孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液中有20～30个左右孢子时，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25％乳酸1～2滴)。

(2) 将已熔化好并冷却到45～50℃的水琼脂培养基约10 ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。

(3) 以振落法相同步骤操作，即可获得单孢系菌种。

(三) 利用直接挑取法进行单孢分离

(1)、挑孢针的制作。把直径为3～4 mm，长约15 cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔，将一个4号昆虫针尾部插入，把针尖部2 mm左右弯折90°而成。

提示：用金属材料制作的挑孢针灭菌容易，不易碰碎，可以长期使用。

(2) 把玉米大斑病病叶置于解剖镜下，寻找目标孢子。可以先在低放大倍率(1×10)下寻找，在高放大倍率(4×10)下，观察是否为单个孢子。

(3) 找到分生孢子后，将挑孢针在酒精灯上高温灭菌，待稍冷却，用挑孢针把孢子粘上，在酒精等火焰上方移入试管斜面培养基上。25培养3～5 d后，观察是否长出纯菌落。

提示：挑孢针在挑取孢子时如果不易黏取，可以先将挑孢针在培养基上轻轻划一下，增加黏性；如果在病叶上目标真菌孢子大量成堆，或周围有其他杂菌的孢子不易分开时，可以取一个干净的载玻片，用挑孢针挑取一些孢子，在载玻片上轻轻碰击，使孢子互相散开，然后在解剖镜下寻找单个孢子，挑取分离。如果进行专性寄生菌的单孢分离，用挑孢针把孢子放在其寄主植物上即可获得单孢菌系。

五、实验作业

上交分离得到的单孢系菌种。

六、思考题

1．如采用在水琼脂平板上用孢子悬液划线后再寻找单孢的方法能否进行；单孢分离?

2．设想还可以采用什么样的方法进行真菌的单孢分离?

3. 用组织法分离长出菌落后，如果多个菌落混杂在一起如何进行进一步的分离纯化?

4. 想一想直接挑取法除了进行单孢分离外还有其他什么用途?

5．单孢子分离技术有哪些优点?

附录3 真菌和细菌的菌种保藏

病原生物纯培养的保存和贮藏技术是比较复杂而十分重要的。在实际研究工作中，经常需要将保存的菌种与一些已知的或已鉴定过的标准菌种对比。而被研究的分离物，一旦鉴定结束，也应妥善保存和贮藏，以便今后进一步研究和对比之用。菌种纯培养的保存和贮藏中最重要的是如何保存这众多的分离物，使之不会因贮藏条件不妥而死亡，不因保存方法不当而发生变异，不被其他生物污染，能长期保存其生命力和原有性状不变。为达此目标，通常都采用部分抑制或完全抑制病原生物的生长和代谢活动的方式以延长其存活期，并减少变异。常用保藏方法有：