流式细胞分析技术
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种广泛使用的细胞分析技术，可以用于分离、鉴定和计数单个细胞，同时可以对细胞的形态、大小、表面分子、细胞器和细胞活性等方面进行分析。
这项技术已经成为生物医学研究和临床诊断的重要工具之一。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮液通过一根细长的玻璃管，使细胞单个地通过一束激光束，利用光学和电子学技术分析细胞的特性。
这个过程可以分为样本制备、细胞计数和细胞分析三个步骤。
样本制备在进行流式细胞术之前，需要对样品进行一系列的处理，以便得到单个、均匀分布的细胞悬浮液。
样品处理的方法包括细胞分离、细胞培养和细胞染色等。
通常使用的染色剂有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素酯和荧光素类核酸探针等。
这些染色剂能够与细胞特定的分子结合，从而标记细胞并使其在流式细胞术中被检测到。
细胞计数细胞计数是流式细胞术的重要步骤之一。
在流式细胞术中，使用一种称为细胞计数器的设备，可以精确地计算细胞的数量。
细胞计数器通常由一个光源、一个流式细胞术仪和一个计算机组成。
在进行细胞计数时，将细胞悬浮液置于流式细胞术仪中，通过一束激光束照射细胞，从而产生荧光信号。
计算机会根据荧光信号的数量和强度来确定细胞的数量。
细胞分析在细胞计数后，可以对细胞进行分析。
流式细胞术中常用的分析方法包括细胞分类、细胞分选和细胞表面分析等。
细胞分类是将细胞根据其形态、大小和荧光特性分为不同的亚群。
细胞分选是将目标细胞从混合的细胞群中分离出来。
细胞表面分析是通过标记细胞表面分子，然后利用流式细胞术检测这些标记物，以确定细胞的特殊表面分子。
总结流式细胞术作为一种高效的细胞分析技术，已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
其基本原理是利用激光束对单个细胞进行分析，以确定细胞的特殊特性。
在进行流式细胞术前需要进行样品制备和细胞计数，然后可以对细胞进行分类、分选和表面分析等分析方法。
流式细胞术的应用范围广泛，可以用于癌症诊断、药物筛选和免疫学研究等领域。
FCM技术
流式细胞分析（FCM）技术概述一、概述流式细胞分析（FCM）技术是诊断病理学的一项重要辅助诊断技术，一般用于组织病理学初步诊断后的进一步分析，应用日益广泛。
1．流式细胞分析技术主要用于肿瘤细胞的①免疫表型分析；②DNA含量分析；③非二倍体细胞定量分析；④细胞增殖活性分析等。
2．制备合格的检测样本是流式细胞分析技术的关键。
3．对样本进行荧光染色或免疫荧光染色流式细胞分析技术检测时，必须同时设立同型抗体对照、阳性对照和自发荧光对照。
4．流式细胞分析技术在淋巴造血组织肿瘤等的病理学诊断中正在成为评估预后和指导治疗的指标，有时可作为独立的病理学诊断报告项目。
5．流式细胞分析报告的内容为由流式细胞仪打印的原始检测结果。
作为病理学诊断报告书组成部分的流式细胞分析报告须经有关病理医师审核后签发，必要时可由病理医师对检测结果作出评论。
二、单细胞悬液的制备（一）新鲜实体瘤单细胞悬液的制备1．酶消化法（1）选取的组织立即放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物。
（2）解剖显微镜下弃除组织块中的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等。
（3）用弯剪将组织块剪成约1.0mm3左右的小块，放在冷组织培养液或生理盐水中。
（4）用冷培养液或生理盐水漂洗剪碎的组织块，洗去被剪碎的细胞碎片。
（5）取约1.0g组织加入适宜的酶消化液。
（6）在37℃的恒温水浴中消化20～30min，消化期间要间断振荡或吹打。
（7）用冷培养液或生理盐水终止消化，收集单细胞悬液。
（8）先后用200目的筛网和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数，总量不少于106个。
根据检测目的作进一步测试。
如做DNA含量分析，须将细胞悬液用70%冰冷乙醇固定，置4℃冰箱保存；如做免疫荧光分析，则不必用乙醇固定。
2．机械法（1）剪碎法①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水或0.01mol/L（pH7.4）的PBS液；②用剪刀将组织剪至匀浆状；③加入0.01mol/LPBS10ml；④用吸管吸取组织匀浆，先以200目的筛网过滤至试管内；⑤离心沉淀（1500r/min，3～5min），再用PBS洗3次，每次离心（500～800r/min）5～8min，除去细胞碎片；⑥以350目的尼龙网过滤，除去凝聚的细胞团块。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
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滤光片
分色反光镜
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PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
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数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
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量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
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经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
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液流系统形成单 个细胞流示意图
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光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
高性能流式细胞术的应用与前景
高性能流式细胞术的应用与前景流式细胞分析技术是一种在生命科学研究中广泛应用的方法，它通过对单个细胞进行高速检测和分离，可以实现对细胞和其表现的分析、分类、定量和分选。
随着计算机、激光等科技的不断发展，流式细胞术技术得到了越来越多的发展，并且取得了突破性的进展。
高性能流式细胞术已经成为不可缺少的技术手段之一，可以用于人类疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
一、高性能流式细胞术的发展历程流式细胞术技术的核心是流式细胞仪，它可以自动地以高速度、连续不断地进行流动细胞的检测和分离，并将细胞经过各种检测和筛选之后进行分选。
早期的流式细胞仪只能够处理少量的细胞，虽然已经能够检测出诸如染色体多样性等重要指标，但是技术精度仍然不高。
随着计算机和激光科技的不断发展，流式细胞仪得到了很大的改进，高性能流式细胞术技术逐渐成为主流。
二、高性能流式细胞术在人类疾病中的应用1. 神经系统疾病的诊断神经系统疾病是极为复杂的疾病，需要通过对数百个神经元进行分析，才能确诊疾病。
高性能流式细胞术可以检测分类和定量这些不同类型的神经元，从而有效地用于神经系统疾病的诊断和治疗。
2. 癌症的早期诊断和治疗高性能流式细胞术可以检测和识别癌细胞，并且还可以检测癌细胞的特定基因和表达模式。
这些数据可以帮助医生确认癌症的类型，并且指导治疗方案的选择。
同时，高性能流式细胞术也可以用于癌症的筛选，从而实现更早期诊断，提高治疗效果。
3. 免疫系统疾病的治疗高性能流式细胞术可以用于免疫细胞检测和治疗，例如在自身免疫性疾病中，可以使用流式细胞仪来检测和分离致病细胞，从而可以进行对症治疗。
在免疫治疗领域中，高性能流式细胞术可以用于治疗一些肿瘤性疾病，例如用T细胞治疗癌症的CAR-T技术。
三、高性能流式细胞术的发展趋势1. 自动化目前的流式细胞仪有很大的改进空间，在未来，它可能会变得更为自动化，从而更加智能化。
比如说，某些流式细胞仪可能会自动进行细胞处理、数据分析和测试结果的输出。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞术工作原理
流式细胞术工作原理流式细胞术又称为流式细胞分析（FACS），是一种用于快速测定和分析细胞及其组分的工具和技术。
它通过对单个细胞的多重参数进行单细胞测量和分析，可对不同种类和状态的细胞进行区分和识别，从而为细胞学、免疫学、实验室诊断和药物研发等领域提供了重要的实验手段和数据支持。
流式细胞术工作原理基于一定的光学原理和电子信号转换技术，其主要步骤包括样本准备、流式细胞仪检测和数据分析等三个部分。
下面将详细介绍各个部分的工作原理：1. 样本准备样本准备是流式细胞术的第一步，它主要是为了将待测细胞或细胞组分转化成能够被流式细胞仪检测和分析的样品，其中包括以下几个步骤：（1）细胞收集：这是流式细胞术的前提条件，它要求待测细胞必须单个存在，不能形成团块或粘连。
通常采用利用酶或化学试剂将细胞从组织、器官、培养基或体液中分离出来进行收集。
其中细胞来源各不相同，可以是血液、骨髓、组织癌变、分离免疫细胞等等。
细胞处理在流式细胞学中是个棘手的问题。
该过程既需要最大程度地维持细胞的原始形态和性质，又不影响流式细胞仪对细胞的检测和分析。
样本处理的方式包括细胞染色、标记、吸释样本预处理等方法，处理条件严格，样品要求高纯度，无污染。
细胞染色是为了能够让细胞在仪器中产生不同的光谱信号。
染色剂的种类有非常多，它们包括活细胞染色剂、细胞膜染色剂、DNA染色剂、标记抗体等。
一般情况下，染色前细胞都要进行适当的处理，如调节pH值、添加细胞破解液等，扩大染色剂与待测细胞的作用。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪是用于测量和分析单个细胞的主要工具和设备，它是由激光器、光学器件、检测单元和计算机组成的。
在具体工作中，样品通过采用压力推动等技术被强制通过一个光学器件中的微细通道，流式细胞仪则通过这个微细通道对其进行检测和分析。
具体步骤如下：（1）激光器发出激光：激光是流式细胞仪最核心的光源，它可以发射可见光、激光、紫外线等光谱范围内的单色光束。
光线经过反射器作用，形成光束。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞术的工作原理
流式细胞术的工作原理流式细胞术是一种现代的细胞分析技术，利用流式细胞仪对单个细胞进行快速、高通量、精确的分析和排序。
其工作原理主要分为样本处理、细胞分析和数据处理三个步骤。
1. 样本处理首先，需要对样品进行处理，以便单细胞可以分开分析。
样品通常包括悬浮细胞、细胞涂片、活体组织或单个细胞。
对于固定细胞或组织，可以通过酶解或化学处理获得单个细胞样品。
对于悬浮细胞，需要进行细胞计数和离心分离，以获得单个细胞的悬浮液。
2. 细胞分析然后，将细胞悬浮液通过流式细胞仪，其基本构造包括光源、光源筛选器、激光、激光筛选器、透镜、光电增强器、光电探测器、信号放大器等部分。
光源激发细胞中的荧光标记，光电探测器检测每个细胞的光信号强度，光电增强器将光信号转换为电信号，再由信号放大器转换为数字化信号储存起来，这样就整理好了细胞波形图。
对于单个细胞，可以分析其荧光标记，如CD标记、抗原结合和荧光染料，以及其其他生物学特征，例如形态、大小、颜色、电势等。
通过测量多个细胞的荧光和特征，可以确定它们的数量和比例，并进一步用于统计学和生物学研究。
3. 数据处理最后，在流式细胞术中，通过使用计算机软件处理数据，可以对分析的细胞进行进一步分类和排序。
通过设置特定的分析门（分析图），可以选择分离特定的细胞亚群或弱阳性细胞。
然后将这些细胞进一步分离或分选，例如将选出的细胞用于培养或鉴定。
流式细胞术的机制和不同的分析方法，包括传统的细胞排序、荧光激发分拣（FACS）、萨玛瑞分拣（SAMBA）等分析方法，也使得它成为了分离和分析抗体、白细胞、基因型和蛋白质的重要工具。
此外，该技术已被应用于肿瘤的诊断和治疗，以及干细胞研究等方面，为现代生物学研究提供了支持。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用一、流式细胞术的原理流式细胞术是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。
通过将单个细胞与特异性抗体结合，实现对细胞表面和内部抗原的定量和定性分析。
抗体通常与荧光染料标记，以便在流式细胞仪中产生光信号。
细胞在流式细胞仪中通过激光束，产生的荧光信号被光电倍增管收集并转换为电信号，从而实现对细胞特性的定量分析。
二、流式细胞术的应用1. 免疫表型分析流式细胞术可用于免疫表型分析，以了解免疫细胞群体的多样性、功能和活性状态。
通过检测特定免疫细胞表面标记物的表达水平，可以评估其发育阶段、激活状态和功能特性。
这种分析对于研究免疫系统功能、疾病发生机制和疫苗开发具有重要意义。
2. 细胞功能分析流式细胞术可用于分析细胞的生理功能，如细胞增殖、凋亡和吞噬作用等。
通过向流式细胞仪中添加特定的荧光染料或抗体，可以检测细胞内关键分子如DNA、RNA、蛋白质等，从而评估细胞的增殖和凋亡状态。
此外，还可以通过检测细胞表面的吞噬标记物，研究细胞的吞噬能力。
3. 基因表达分析流式细胞术可用于基因表达分析，以了解特定基因在细胞中的表达水平。
通过将RNA与特异性抗体结合，并使用荧光染料标记，可以检测细胞中特定基因的表达水平。
这种分析有助于研究基因功能、疾病诊断和药物筛选。
4. 病原体检测流式细胞术可用于病原体检测，以快速准确地识别和计数感染性疾病的病原体。
通过将特异性抗体与病原体结合，并使用荧光染料标记，可以在流式细胞仪中实现对病原体的定量和定性分析。
这种分析对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
5. 肿瘤诊断和治疗流式细胞术在肿瘤学中也有广泛的应用。
通过对肿瘤细胞的表面抗原、基因表达和细胞功能进行分析，有助于肿瘤的诊断、分类、预后评估和治疗策略的制定。
此外，流式细胞术还可以用于监测肿瘤细胞的耐药性和对治疗的反应，为个体化治疗提供依据。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术（FACS）是一种广泛应用于生命科学领域的高通量细胞分析和分选技术。
其基本原理和实用技术如下：
一、样品准备
在进行FACS之前，需要将细胞悬浮液或组织细胞碎片通过过滤器过滤，以得到单个细胞的悬浮液。
随后将悬浮液加入到含有一定细胞标记物的荧光染料中，使得细胞表面有区分不同群体的标记，例如细胞表面抗原。
荧光染料可以是分子量小的化合物、抗体标记分子、蛋白质标记分子等。
二、设备设置
FACS设备由荧光激发器、荧光检测器、样品流动池和高压流速控制系统等部件组成。
通过设置荧光染料所需要的激发波长和收集的荧光波长，将荧光激发器和荧光检测器调整至适当的位置。
对于每个荧光染料，需要设定收集的波长范围和门控系统。
三、样品检测
将样品导入样品流动池，以产生细胞流动并通过荧光激发器。
在每一个单独的荧光染料发射峰之前，设立门道，用于筛选荧光信号并选择相应的背景噪音水平。
样品流过荧光激发器时，所产生的荧光信号将被荧光检测器收集。
四、数据分析
利用计算机软件处理和分析获得的荧光信号数据，得到针对不同细胞类型、各种特征和功能的排序和分析。
通过流式细胞仪可以实现单个细胞的荧光测量和分类，将这些数据转化为数值和图像，并对细胞进行进一步的单个细胞功能、结构和组成分析等。
综上所述，流式细胞术已成为现代细胞学、免疫学、生物学等领域中的一种必不可少的技术。
其基本原理和实用技术结合起来，可以让科研工作者更深入地了解细胞的结构、功能、组成以及色素、蛋白
质等分子的表达规律，全面、准确地分析和研究生命体系，推进科学研究和医学进步。
基于流式细胞术技术的细胞分析研究及其应用
基于流式细胞术技术的细胞分析研究及其应用细胞是生命的基本单位，对于细胞的分析研究在现代生命科学研究中扮演着至关重要的角色。
流式细胞术技术是一种广泛应用于细胞分析的现代技术，其基于光学和电子学原理，能够在极短时间内对数以万计的细胞进行高效分析，既保留了单细胞的细节信息，又能够得出总体的统计结果。
本文将通过对流式细胞术技术的介绍、应用和前景展望，探究其在细胞分析领域的重要性和发展潜力。
一、流式细胞术技术的发展历程流式细胞术技术最早于1965年由Wallace H. Coulter发明，初期主要用于血细胞计数，后来由Leonard Herzenberg在早期开创性的研究中广泛应用于细胞表型鉴定和功能分析。
近些年，随着相关技术的不断完善和成熟，其应用领域也越来越广泛，已经涉及到免疫学、细胞生物学、药物研发和临床医学等多个领域，成为现代生命科学的重要分析手段之一。
二、流式细胞术技术的基本原理流式细胞术技术主要基于细胞的大小和复杂度（复杂性）不同，而表现出的不同反射和荧光特性来进行细胞分析。
在流动系统下，将单个细胞通过一束激光束，发生散射并放射荧光，再根据细胞特定的散射和荧光信号，通过光学、电学或磁学等方法进行分选和分析。
其中，散射指的是激光传播时，光线与细胞进行相互作用产生散射的现象，常用于细胞大小、形态及表面特征的分析；荧光是指特定荧光染料激发后的反射光，用于标记和分析细胞表面或细胞内的生物分子。
三、流式细胞术技术在细胞分析领域的应用（一）免疫表型鉴定流式细胞术技术在免疫表型鉴定方面应用非常广泛。
以人类白细胞抗原（HLA）分型为例，该技术能够通过荧光染料标记不同亚型HLA分子，从而快速高效地进行HLA基因型的鉴定；同时，该技术还可用于检测和分析细胞表面蛋白（如CD4、CD8等）的表达情况，从而对各种疾病的发生机制进行深入研究。
（二）药物筛选和研发流式细胞术技术在药物筛选和研发中也有广泛的应用。
利用荧光标记技术，可以对药物作用的细胞进行准确检测和筛选，从而实现对抗肿瘤、炎症等疾病的治疗药物研发。
流式细胞技术意义及操作要点
将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本， 在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不 含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从 鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒 流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流 动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞 在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪 的检测区域。
§3.1 荧光探针的选择
2. 藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自 然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对 于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用 585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞 仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器 检测PE。
FITC FITC
Number of Events
Fluorescent Intensity
§2.2 工作原理
5. 数据的存贮、显示与分析
FCM数据存贮的方式均采用列表排队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二维点图 等。
§2.2 工作原理
单参数直方图
二维散点图
§2.3 细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方 的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频 率进行振动，使液流注断裂成一连串均匀的液 滴，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的 空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞 的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充 电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选 参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液 滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电 荷是正或是负而发生向右或向左的偏转，落入 指定的收集器中，完成细胞分选的目的。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（flow cytometry）是一种常用的细胞分析和分选技术，通过对悬浮细胞进行连续的、高通量的单细胞多参数分析，能够准确地获得细胞的多种信息，如大小、形态、表面标记物、蛋白质表达水平、细胞周期等。
流式细胞术的原理基于光学系统和流式细胞仪的相互配合。
其基本原理如下：1. 细胞样品制备：将待分析的细胞样品进行预处理，如去除细胞碎片、异物、血细胞混杂等，使其成为适合流式细胞仪分析的单细胞悬浮液。
2. 光源和染料：流式仪器利用一束单色、高能、激光光源对悬浮细胞进行照射。
细胞内染料的选择取决于研究目的，如荧光染料可用于标记特定蛋白质、细胞器或细胞表面受体。
3. 光学系统：经过光源照射后，激光光线经过特定的滤光片进行滤波，以选择特定波长的荧光信号。
光线通过一个透镜经过流式细胞仪的进样通道瞬间击中正在流动的细胞。
击中细胞的激光光线会被散射，产生前向散射光和侧散射光。
4. 散射光检测：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）是流式细胞仪最基本的检测参数。
FSC反映细胞的大小和形态，SSC则反映细胞的复杂度和内部结构。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪在经过细胞后会收集产生的荧光信号。
通过特定的荧光滤光片，选择出目标染料所发射的波长范围，并通过光电倍增管转化为电信号。
这些电信号被记录下来，并转化为数据。
6. 数据分析：流式细胞术生成的数据会在计算机中进行分析和解读。
通常会用分析软件对荧光信号进行解析，进一步分析细胞表型、蛋白质表达、细胞周期等信息。
通过上述原理，流式细胞术能够快速准确地进行细胞的高通量分析和分选，为生物学、医学等领域的研究提供了重要工具。
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流式细胞发展史
1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人， 他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 （从固定式细胞 分析-流动式） 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红 细胞光学自动计数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细 胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出 细胞分选的方法。
Laser
FSC
荧光
SSC
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细胞散色光信号
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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90 Degree Light Scatter (SSC)
Laser
FALS Sensor
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流动室（Flow Chamber）
流动室由样品管、鞘液管 和喷嘴等组成，常用光学 玻璃、石英等透明、稳定 的材料制作，是液流系统 的心脏。 样品管贮放样品，单个细 胞悬液在液流压力作用下 从样品管射出；
鞘液由鞘液管从四周流向 喷孔，包围在样品外周后 从喷嘴射出。
Injector Tip
Laser
FALS Sensor
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流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞 定量分析技术
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FCM还可在对样品细胞多参数分析测定的基础上，结 合多种细胞生物学特性，将样品中特定的细胞亚群高 纯度地分选（sorting）出来（活细胞点对点分选）， 单独收集以供进一步深入研究 如：形态学检查、细胞功能研究、细胞培养、分子生 物学研究
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。 上海交通大学医学院
BD FACSCanto II 液流系统
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（2）激发光源与光束成形系统
激光（Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源。 单波长，高强度，高稳定性 FCM 的激发光源大多采用氩离子气体激光器（488nm），一些FCM也 配有其他各种激光器，如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染 料激光器和半导体激光器等。 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关 . 上海交通大学医学院
Байду номын сангаас
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
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SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
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细胞散色光信号
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（2）细胞荧光信号
主要包括两部分： ①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光 照射后所发出的荧光； ②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照 而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。 自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧 光信号的分辨和测量。
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层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层 流的形成要满足雷诺数 dρV Re = < 2300， η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d 和V分别为管道的直径和液体的平均流速。 FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自 聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.
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样品细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射， 同时产生细胞的散射光信号和细胞的荧光信号。 这些信号以被检细胞为中心向空间360度立体 角发射
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细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所 使用的荧光素种类 近年来荧光素化学技术发展很快，现已可做到 用一束激光（488nm）激发三种染料（甚至四 种或更多染料）而得到各自波长不同的荧光。 这已能满足目前大多数研究和临床检验工作的 需要
细胞荧光信号
荧光信号的测量：
经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式 有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log):
AMP
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细胞荧光信号
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 线性测量 对数测量
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流式细胞发展史
1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM （即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明 第一台荧光检测细胞计。 1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够 检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了 世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式 细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。 1979年， SSMU: FCM 推广 1980年， BJNU: 国内第一台 FCM (FACS III) 进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻 完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式 细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域， 并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。
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从定量的角度研究
- 细胞的形态学参数
- 生物学特征 - 细胞化学成分及含量 - 细胞的功能
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概念
流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。
上海交通大学医学院 光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
信号转换系统:光
电
数字信号
PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉 冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.
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（二）细胞信号的检测与分析
制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到
激发光的照射.激光与细胞相互作用后可产生
鞘液
荧光信号
激光束
通过流动室后细 胞一个一个排列 成单行,依次通过 检测区.把流动室
称为单细胞流
发生器 . 上海交通大学医学院
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度 υ <10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被 限制在液流的轴线上。
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液流驱动系统（示意图）
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BD FACSCanto II
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讲课内容
1 2 3
基础理论
细胞样品制备技术
在医学生物学中的应用
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基础理论 （一）FCM仪器的一般结构
Y
细胞流动室及其液流驱 动系统（Z） 激发光源及其光束成形 系统（X） 细胞信号检测（Y）分析、 显示、记录系统
FCM检测分析的细胞荧光信号主要指经过特异荧光染色后细胞受 照发射的荧光信号
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自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
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特 异 染 色 的 荧 光 信 号
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荧光信号的线性测量 对数测量 荧光光谱重叠及其校正方法
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光收集系统：光电倍增管（PMT）
细胞散色光的波长是与激发光波长一致的. 前向散色光信号:检测器采用光电二极管 侧向及荧光信号用光电倍增管（PMT）
流动细胞 双色滤镜
PMT
2
PMT 4
PMT
3
Bandpass Filters
PMT
1
光电管
激光
荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管 （PMT）检测。 PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的 光谱区，光量子产额都比较高。
球透镜和柱面透镜 ： 20×200m 椭圆形光斑，短轴和细胞流平 行，长轴与细胞流垂直。
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光 束 成 形 与 细 胞 受 照 方 式
这种椭圆形光斑的
检测区保证每个细
胞分别受到光照 且受检时受到一致
激发光焦斑
的光照
FCM的
单细胞照明技术.
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（3）细胞信号检测与分析处理系统
光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。 若激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，即可同时检 测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。 对于有较高水平自发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使用较高发 射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有一个较好 信噪比的结果。 对于那些不是有较多自发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使用FITC 标 记的抗体了。