流式细胞分析技术
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样品细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射， 同时产生细胞的散射光信号和细胞的荧光信号。 这些信号以被检细胞为中心向空间360度立体 角发射
上海交通大学医学院
细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所 使用的荧光素种类 近年来荧光素化学技术发展很快，现已可做到 用一束激光（488nm）激发三种染料（甚至四 种或更多染料）而得到各自波长不同的荧光。 这已能满足目前大多数研究和临床检验工作的 需要
散色光信号和荧光信号.
上海交通大学医学院
（1）细胞散射光信号
前向角散射信号（Forward Scatter, FSC）:收 集的细胞散射光信号的强弱与细胞的大小及活 力有关 侧向角散射光信号（Side Scatter, SSC）又称 90度角散射光，对细胞膜、胞质、核膜的折射 更敏感，其中特别是胞质的颗粒成分
上海交通大学医学院
要保证荧光染料与所研究的细胞参数的结合是 特异性的和定量关系的。这样，通过对细胞荧 光信号的检测和定量就能了解所研究的细胞参 数存在与否与量的多少
上海交通大学医学院
单激光器FCM至少配置有三个光电倍增管分别 接受三种不同波长的荧光信号。并附有荧光补 偿电路、或荧光补偿软件来消除荧光光谱相互 重叠带来的测量误差。
流式细胞分析技术
王也飞
http://www.shsmu.edu.cn/
分析细胞学
年轻的交叉学科
定量细胞学 细胞生物学的一个重要分支
上海交通大学医学院
与之相关的科学技术
激光技术 数字计算机技术 电子物理技术 电子摄像技术 光电测量技术 荧光细胞化学技术 单克隆抗体技术等
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BD FACSCanto II
上海交通大学医学院
讲课内容
1 2 3
基础理论
细胞样品制备技术
在医学生物学中的应用
上海交通大学医学院
基础理论 （一）FCM仪器的一般结构
Y
细胞流动室及其液流驱 动系统（Z） 激发光源及其光束成形 系统（X） 细胞信号检测（Y）分析、 显示、记录系统
上海交通大学医学院
流动室（Flow Chamber）
流动室由样品管、鞘液管 和喷嘴等组成，常用光学 玻璃、石英等透明、稳定 的材料制作，是液流系统 的心脏。 样品管贮放样品，单个细 胞悬液在液流压力作用下 从样品管射出；
鞘液由鞘液管从四周流向 喷孔，包围在样品外周后 从喷嘴射出。
Injector Tip
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为实现单个细胞的均匀照射，FCM一般都采用二块相互 垂直放置的柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透镜所 组成的光束成形系统对激光束进行适当的聚焦，形成截 面为椭圆形的照射光斑。 此光斑正处于FCM仪器中三条正交轴线的交点，即仪器 的检测区。
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光 束 成 形 与 细 胞 受 照 方 式
FCM检测分析的细胞荧光信号主要指经过特异荧光染色后细胞受 照发射的荧光信号
上海交通大学医学院
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
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特 异 染 色 的 荧 光 信 号
上海交通大学医学院
荧光信号的线性测量 对数测量 荧光光谱重叠及其校正方法
上海交通大学医学院
细胞荧光信号
荧光信号的测量：
经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式 有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log):
AMP
上海交通大学医学院
细胞荧光信号
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 线性测量 对数测量
上海交通大学医学院
光收集系统：光电倍增管（PMT）
细胞散色光的波长是与激发光波长一致的. 前向散色光信号:检测器采用光电二极管 侧向及荧光信号用光电倍增管（PMT）
流动细胞 双色滤镜
PMT
2
PMTห้องสมุดไป่ตู้4
PMT
3
Bandpass Filters
PMT
1
光电管
激光
荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管 （PMT）检测。 PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的 光谱区，光量子产额都比较高。
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流式细胞发展史
1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM （即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明 第一台荧光检测细胞计。 1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够 检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了 世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式 细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。 1979年， SSMU: FCM 推广 1980年， BJNU: 国内第一台 FCM (FACS III) 进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻 完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式 细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域， 并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。
球透镜和柱面透镜 ： 20×200m 椭圆形光斑，短轴和细胞流平 行，长轴与细胞流垂直。
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光 束 成 形 与 细 胞 受 照 方 式
这种椭圆形光斑的
检测区保证每个细
胞分别受到光照 且受检时受到一致
激发光焦斑
的光照
FCM的
单细胞照明技术.
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（3）细胞信号检测与分析处理系统
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层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层 流的形成要满足雷诺数 dρV Re = < 2300， η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d 和V分别为管道的直径和液体的平均流速。 FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自 聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.
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上海交通大学医学院
从定量的角度研究
- 细胞的形态学参数
- 生物学特征 - 细胞化学成分及含量 - 细胞的功能
上海交通大学医学院
概念
流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。
鞘液
荧光信号
激光束
通过流动室后细 胞一个一个排列 成单行,依次通过 检测区.把流动室
称为单细胞流
发生器 . 上海交通大学医学院
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度 υ <10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被 限制在液流的轴线上。
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液流驱动系统（示意图）
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流式细胞发展史
1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人， 他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 （从固定式细胞 分析-流动式） 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红 细胞光学自动计数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细 胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出 细胞分选的方法。
Laser
FALS Sensor
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流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞 定量分析技术
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FCM还可在对样品细胞多参数分析测定的基础上，结 合多种细胞生物学特性，将样品中特定的细胞亚群高 纯度地分选（sorting）出来（活细胞点对点分选）， 单独收集以供进一步深入研究 如：形态学检查、细胞功能研究、细胞培养、分子生 物学研究
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。 上海交通大学医学院
BD FACSCanto II 液流系统
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（2）激发光源与光束成形系统
激光（Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源。 单波长，高强度，高稳定性 FCM 的激发光源大多采用氩离子气体激光器（488nm），一些FCM也 配有其他各种激光器，如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染 料激光器和半导体激光器等。 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光
Z 细胞流轴线
细胞荧光 信号检测轴线
X 激发光轴线
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FCM从原理上讲是一种在计算机技术支持下的 高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
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（1）流动室与液流驱动系统
流动室（Flow Chamber/Flow Cell）是流式细胞仪的 核心部件。被检样品的细胞悬液流经流动室时，由液 体动力学层流技术保证，其中的细胞一个一个排列成 单行，逐个依次通过检测区 流动室也可称为单细胞流发生器
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发射光波长
异硫氰酸荧光素 ，525nm（绿） Phycoerythrin 藻红蛋白，575nm（橙红）
peridinin chlorophyll protein多甲藻叶绿素蛋白 最大激发波峰490nm，被488nm的氩离子激光 激发后，发射光峰值约为677nm，与FITC、 PE进行多色荧光染色补偿重叠较少，非特异性结合也较少。 虽然较易使用，但量子产量不高，多用于检测表达较高的抗原。 allophycocyanin别藻青蛋白，最大吸收峰：650nm， 最大发射荧光峰：660nm，适用于双激光流式仪，可被600640nm波长的激光激发。
Laser
FSC
荧光
SSC
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细胞散色光信号
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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90 Degree Light Scatter (SSC)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关 . 上海交通大学医学院
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
上海交通大学医学院
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
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细胞散色光信号
上海交通大学医学院
（2）细胞荧光信号
主要包括两部分： ①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光 照射后所发出的荧光； ②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照 而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。 自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧 光信号的分辨和测量。
光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。 若激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，即可同时检 测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。 对于有较高水平自发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使用较高发 射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有一个较好 信噪比的结果。 对于那些不是有较多自发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使用FITC 标 记的抗体了。
上海交通大学医学院 光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
信号转换系统:光
电
数字信号
PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉 冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.
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（二）细胞信号的检测与分析
制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到
激发光的照射.激光与细胞相互作用后可产生
上海交通大学医学院
细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所 使用的荧光素种类 近年来荧光素化学技术发展很快，现已可做到 用一束激光（488nm）激发三种染料（甚至四 种或更多染料）而得到各自波长不同的荧光。 这已能满足目前大多数研究和临床检验工作的 需要
散色光信号和荧光信号.
上海交通大学医学院
（1）细胞散射光信号
前向角散射信号（Forward Scatter, FSC）:收 集的细胞散射光信号的强弱与细胞的大小及活 力有关 侧向角散射光信号（Side Scatter, SSC）又称 90度角散射光，对细胞膜、胞质、核膜的折射 更敏感，其中特别是胞质的颗粒成分
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要保证荧光染料与所研究的细胞参数的结合是 特异性的和定量关系的。这样，通过对细胞荧 光信号的检测和定量就能了解所研究的细胞参 数存在与否与量的多少
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单激光器FCM至少配置有三个光电倍增管分别 接受三种不同波长的荧光信号。并附有荧光补 偿电路、或荧光补偿软件来消除荧光光谱相互 重叠带来的测量误差。
流式细胞分析技术
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http://www.shsmu.edu.cn/
分析细胞学
年轻的交叉学科
定量细胞学 细胞生物学的一个重要分支
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与之相关的科学技术
激光技术 数字计算机技术 电子物理技术 电子摄像技术 光电测量技术 荧光细胞化学技术 单克隆抗体技术等
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讲课内容
1 2 3
基础理论
细胞样品制备技术
在医学生物学中的应用
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基础理论 （一）FCM仪器的一般结构
Y
细胞流动室及其液流驱 动系统（Z） 激发光源及其光束成形 系统（X） 细胞信号检测（Y）分析、 显示、记录系统
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流动室（Flow Chamber）
流动室由样品管、鞘液管 和喷嘴等组成，常用光学 玻璃、石英等透明、稳定 的材料制作，是液流系统 的心脏。 样品管贮放样品，单个细 胞悬液在液流压力作用下 从样品管射出；
鞘液由鞘液管从四周流向 喷孔，包围在样品外周后 从喷嘴射出。
Injector Tip
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为实现单个细胞的均匀照射，FCM一般都采用二块相互 垂直放置的柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透镜所 组成的光束成形系统对激光束进行适当的聚焦，形成截 面为椭圆形的照射光斑。 此光斑正处于FCM仪器中三条正交轴线的交点，即仪器 的检测区。
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光 束 成 形 与 细 胞 受 照 方 式
FCM检测分析的细胞荧光信号主要指经过特异荧光染色后细胞受 照发射的荧光信号
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自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
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特 异 染 色 的 荧 光 信 号
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荧光信号的线性测量 对数测量 荧光光谱重叠及其校正方法
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细胞荧光信号
荧光信号的测量：
经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式 有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log):
AMP
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细胞荧光信号
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 线性测量 对数测量
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光收集系统：光电倍增管（PMT）
细胞散色光的波长是与激发光波长一致的. 前向散色光信号:检测器采用光电二极管 侧向及荧光信号用光电倍增管（PMT）
流动细胞 双色滤镜
PMT
2
PMTห้องสมุดไป่ตู้4
PMT
3
Bandpass Filters
PMT
1
光电管
激光
荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管 （PMT）检测。 PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的 光谱区，光量子产额都比较高。
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流式细胞发展史
1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM （即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明 第一台荧光检测细胞计。 1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够 检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了 世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式 细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。 1979年， SSMU: FCM 推广 1980年， BJNU: 国内第一台 FCM (FACS III) 进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻 完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式 细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域， 并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。
球透镜和柱面透镜 ： 20×200m 椭圆形光斑，短轴和细胞流平 行，长轴与细胞流垂直。
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光 束 成 形 与 细 胞 受 照 方 式
这种椭圆形光斑的
检测区保证每个细
胞分别受到光照 且受检时受到一致
激发光焦斑
的光照
FCM的
单细胞照明技术.
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（3）细胞信号检测与分析处理系统
上海交通大学医学院
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层 流的形成要满足雷诺数 dρV Re = < 2300， η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d 和V分别为管道的直径和液体的平均流速。 FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自 聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.
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从定量的角度研究
- 细胞的形态学参数
- 生物学特征 - 细胞化学成分及含量 - 细胞的功能
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概念
流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。
鞘液
荧光信号
激光束
通过流动室后细 胞一个一个排列 成单行,依次通过 检测区.把流动室
称为单细胞流
发生器 . 上海交通大学医学院
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度 υ <10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被 限制在液流的轴线上。
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液流驱动系统（示意图）
上海交通大学医学院
流式细胞发展史
1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人， 他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 （从固定式细胞 分析-流动式） 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红 细胞光学自动计数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细 胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出 细胞分选的方法。
Laser
FALS Sensor
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流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞 定量分析技术
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FCM还可在对样品细胞多参数分析测定的基础上，结 合多种细胞生物学特性，将样品中特定的细胞亚群高 纯度地分选（sorting）出来（活细胞点对点分选）， 单独收集以供进一步深入研究 如：形态学检查、细胞功能研究、细胞培养、分子生 物学研究
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。 上海交通大学医学院
BD FACSCanto II 液流系统
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（2）激发光源与光束成形系统
激光（Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源。 单波长，高强度，高稳定性 FCM 的激发光源大多采用氩离子气体激光器（488nm），一些FCM也 配有其他各种激光器，如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染 料激光器和半导体激光器等。 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光
Z 细胞流轴线
细胞荧光 信号检测轴线
X 激发光轴线
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FCM从原理上讲是一种在计算机技术支持下的 高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
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（1）流动室与液流驱动系统
流动室（Flow Chamber/Flow Cell）是流式细胞仪的 核心部件。被检样品的细胞悬液流经流动室时，由液 体动力学层流技术保证，其中的细胞一个一个排列成 单行，逐个依次通过检测区 流动室也可称为单细胞流发生器
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发射光波长
异硫氰酸荧光素 ，525nm（绿） Phycoerythrin 藻红蛋白，575nm（橙红）
peridinin chlorophyll protein多甲藻叶绿素蛋白 最大激发波峰490nm，被488nm的氩离子激光 激发后，发射光峰值约为677nm，与FITC、 PE进行多色荧光染色补偿重叠较少，非特异性结合也较少。 虽然较易使用，但量子产量不高，多用于检测表达较高的抗原。 allophycocyanin别藻青蛋白，最大吸收峰：650nm， 最大发射荧光峰：660nm，适用于双激光流式仪，可被600640nm波长的激光激发。
Laser
FSC
荧光
SSC
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细胞散色光信号
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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90 Degree Light Scatter (SSC)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关 . 上海交通大学医学院
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
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SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
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细胞散色光信号
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（2）细胞荧光信号
主要包括两部分： ①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光 照射后所发出的荧光； ②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照 而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。 自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧 光信号的分辨和测量。
光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。 若激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，即可同时检 测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。 对于有较高水平自发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使用较高发 射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有一个较好 信噪比的结果。 对于那些不是有较多自发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使用FITC 标 记的抗体了。
上海交通大学医学院 光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。
信号转换系统:光
电
数字信号
PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉 冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.
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（二）细胞信号的检测与分析
制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到
激发光的照射.激光与细胞相互作用后可产生