免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

玻片法---人血型鉴定结果判断
标准抗A血清 标准抗B血清
O型 B型 A型 AB型
双向免疫扩散
实验原理：将可溶性抗原和相应抗体分别加到琼 脂糖凝胶板相对应的孔中，两者各自向四周 扩散，若二者相对应，在比例合适处会形成 白色沉淀线。若同时含有多种抗原抗体系统， 则在琼脂层中形成多条沉淀线。同时，还会 因抗原抗体的相对浓度、分子质量的差异而 使沉淀线的部位、形状出现差异，从而对抗 原进行定性、半定量及组分分析，对抗体进 行定性及效价测定等。
动脉开口示意图
正上方
B止血钳
正上方
c止血钳
身
头
E开口处
下前方
占血管直径1/3
A系索线角瓶0.5-1h； 2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）； 3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜； 4、次日（时间待定）：估计各班分离的血清量并观察描述血
清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加 叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装 小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
实验三：抗体效价检测
（一） 间接ELISA法测定 （二）双向免疫扩散试验测定
ELISA原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起 来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗 原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体( 抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的 底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收 计算抗体(抗原)的量。
编号标记方法
实验动物分组后，为了区分、观察并记录每个个体的 反应情况，必须给每只动物进行编号标记。
1．体表颜料着色法 一般对短期试验的白色动物 可用颜料涂搽被毛的方法标记。常用的涂染化学药品 有：
红色：0.5％中性红或品红溶液； 黄色：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸 酒精饱和液； 咖啡色：2％硝酸银溶液； 黑色：煤焦油酒精溶液。
• 玻片法可用于细菌的快速鉴定和血型鉴定等，是一 种定性试验。
Ⅰ、试管法直接凝集试验方法和步骤：
1、Ag稀释（用生理盐水稀释B.t.H-Ag至相当于 McFarland比浊管第6支的浓度，约10亿/ml）：4人一 组，0.1-0.6mlAg到6ml生理盐水中。
2、Ab稀释（见图）：兔抗4人B.t.H-Ag抗体，4人一组 作1套抗体稀释。
目标：制备高效价的抗血清
1 实验动物的免疫反应性 2抗 原 的 免 疫 原 性 3抗 原 的 剂 量 4免 疫 途 径 5免 疫 时 间 间 隔
实验动物的选择
• 常用的免疫动物： 家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。 • 免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择
选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂 沫在动物的背部，作出明确的标记。 • 应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免 疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
直接凝集试验
• 直接凝集试验原理：在电解质存在的情况下，颗
粒性抗原（如细菌菌体或鞭毛、红细胞等）与相应 抗体混合一定时间后，发生特异性结合而生成抗原 抗体复合物，便可出现肉眼可见的凝集块。直接凝 集试验又分试管法和玻片法。
• 直接凝集试验用途： • 试管法不仅用于未知抗原（如细菌）或抗体的鉴定，
还可测定抗体的效价。
为避免伤及内脏，可使动 物处于头低位，使内脏移 向上腹。
免疫的时间间隔
• 可溶性抗原，首免3周后，二免后间隔10天 • 颗粒性抗原，1~2周/次
本季推荐免疫方案
免疫 免疫时间 次数 负责班级
家兔免疫途径
备注
初免 9月28日 脚掌0.2 ml，肌肉0.3 ml，皮 1：1混合完全 （生工） 下共 0.3 ml，耳静脉0.2ml 福氏佐剂
左前
腿上部为
1，左腰 部为2， 左后腿为
3，头部 为4，背 部为5， 尾基部为
6，
右侧从前至后依次为7、8、9。用黄 色表示个位数，红色表示十位数。
抗原的免疫原性
• 完全抗原 or 半抗原？ 半抗原+蛋白质载体
• 免疫原性强 or 弱？ 免疫原性弱的抗原+佐剂
免疫的剂量
合成免疫原为2mg(半抗原约为20～200 μg)。
间接ELISA法原理
间接ELISA法实验方法和步骤
1、Ag包被过夜：用包被缓冲液稀释Ag至10 μg /ml），每孔加100 μl，4 ℃ 过 夜。次日用PBST满孔洗涤3次。 2、加待测一抗孵育：用PBST倍比稀释Ab至1：500，1：1000，1：2000，1： 4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，取100 μl 加入 到已包被Ag的孔中，每个稀释度加3个孔(同时做空白、阴性及阳性孔对照) ， 37 ℃ 孵育1h。 PBST满孔洗涤4次，在吸水纸垫上拍干。 3、加酶标二抗：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(按说明书的要求 以PBST进行稀释) 100 μl ， 37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 4、加底物液反应显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml， 37℃显色10～30分钟。 5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50 μl 。 6、结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若大于0.2且为阴性对照OD值的2.0倍，即为阳性。
如：待测抗原组分一相 对应的抗体的效价为1： X。 汇总本组实验结果， 以出现沉淀线抗体的 最高稀释倍数为该抗 体效价。
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实验结果
管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
号
ck
稀 释 倍 数
凝 集 程 度
待测抗体的效价是1：？
Ⅱ、玻片法—血型鉴定（兴趣实验）
实验材料：
1、Ag：受检血样（红细胞悬液） 2、Ab：标准抗A血清、标准抗B血清
（单克隆抗体，不同于标准A型血清、 B型血清）。
实验方法和步骤：
以出现50%凝集（++）的抗体最高稀释 倍数，为抗体的效价。
凝集反应程度的判断标准：
++++ 100%凝集（完全凝集，上层变清） +++ 75%凝集（绝大部分凝集，上层略浑） ++ 50%凝集（部分凝集，上层较浑） + 25%凝集（很少部分凝集，上层浑浊） - 无凝集（液体浑浊，与阴性对照管相同）
0.10ml
理
Ag
盐 水
2X 4X 8X 16X 32X
学号 01 02 03 04
Ab稀释示意图
0.10ml
生
理
抗 0.10ml 0.10ml
盐
体
水
2X 4X 8X 16X 32X CK（无抗体）
兔抗牛血清抗体或兔抗牛血清白蛋白抗体
次日观察双扩实验结果， 用铅笔绘图并分析判断：
待测Ag各组分相对应的 Ab的效价？
（三）颈动脉放血
• 家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动 脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动 脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2 条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。
• 注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不 要剪破毛细动脉管！！！
3、加Ag到Ab稀释管。 4、37℃水浴2-4小时。 5、结果观察及判定Ab的效价。
抗体的稀释示意图
生理盐水
注意事项： 1、每一稀释度需换一个枪头； 2、对照管不可加入抗体。 3、抗原、抗体不可在凝集管外相混；抗原 （抗体）不可混入生理盐水瓶。 4、半小时后可以看初步的结果。
H抗原
试管法直接凝集试验结果判断
动物抓取方式
动物控制和免疫演示……
实验二：抽血、放血，分离抗血清
颈静脉或颈动脉采血
尾 部 采 血
（一）耳静脉抽血
• 用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决 定加强免疫或放血。
• 与耳静脉注射方式相反。
（二）心脏抽血
• 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重 复上述操作继续抽血，直至抽完。
双扩实验步骤
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
01
ck
Ab低浓度 Ag高浓度
Ab高浓度 Ag低浓度
Ag：牛血清白蛋白
Ag稀释示意图
0.10ml
生
0.10ml
实验内容
主线：抗血清制备及抗体效价检测
实验一：免疫（4学时） 实验二：抽血、放血，分离抗血清（4学时） 实验三：抗体效价检测（12学时）
（一）ELISA （二) 双向免疫扩散试验 （三）血型鉴定
实验一：免疫
抗血清制备的原理
用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体 后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分 泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免 疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后 采集动物血液，再从血液中分离析出血清， 从而获得抗血清。
家兔为300～600 μg/次（400），每次不超 过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20），