抗生素的配制

抗生素????贮存液a????工作浓度
????浓度????保存条件????严紧型质粒????松弛型质粒
氨苄青霉素????50mg/ml(溶于水)????-20℃????20μg/ml????60μg/ml
羧苄青霉素????50mg/ml(溶于水)????-20℃????20μg/ml????60μg/ml
氯霉素????34mg/ml(溶于乙醇)????-20℃????25μg/ml????170μg/ml
卡那霉素????10mg/ml(溶于水)????-20℃????10μg/ml????50μg/ml
链霉素????10mg/ml(溶于水)????-20℃????10μg/ml????50μg/ml
四环素b????5mg/ml(溶于乙醇)????-20℃????10μg/ml????50μg/ml
a：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。

以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。

所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

常用抗生素?
氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）?
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）?
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）?
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。

?
卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）?
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）?
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
链霉素（streptomycin）（50mg/ml）?
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
萘啶酮酸（nalidixicacid）（5mg/ml）?
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

?
四环素（tetracyyline）（10mg/ml）?
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。

分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

几种溶液的配制方法
1、PBS:
????取ZLI-9061PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。

2、TBS：
????2.1Tris缓冲液配方：（0.5M??pH7.6）
????????????Tris（三羟甲基氨基甲烷）????????60.57g
????????????1NHCL????????约420ml
????????????双蒸水????????加至1000ml
????Tris缓冲液配制方法：
????????先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6，最后双蒸水加至1000ml。

此液为储备液，4℃冰箱中保存。

????2.2TBS配方：
????????????Tris-HCI缓冲液（0.5M??pH7.6）????????100ml ????????????NaCI????????8.5~9g(0.15mol/L)
????????????双蒸水????????加至1000ml
????TBS配制方法：
????????先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。

????3、枸橼酸盐缓冲液（Citratebuffer）：
????3.1储存液：
????A.0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7?H20）溶于1000ml蒸馏水中。

????B.0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5Na3O7?2H20）溶于1000ml蒸馏水中。

????3.2工作液：
????取9mlA液和41mlB液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.1
?????
????4、胰酶（Trypsin）：
????4.1ZLI-9011胰蛋白酶消化液：
????常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。

胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。

????4.2ZLI-9010胰蛋白酶：
????取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。

????5、胃酶（Pepsin）：
4%胃蛋白酶，用0.1mol/LHCL配制。

（我公司备有ZLI-9013胃蛋白酶消化工作液，不需稀释直接滴加使用，欢迎选购）????6、DAB：
????6.1ZLI-9032/9033DABKit：
????使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得
1mlDAB工作液，简单易用。

????6.1ZLI-9030DAB：
????6mgDAB溶于10mlTBS（0.05M??pH7.6），再加入0.1ml浓度为3％的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。

7、AEC：
4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml3%H2O2，过滤掉沉淀物。

8、RIPA：
1×PBS，1%NP40，0.5sodiumdeoxycholate，0.1%SDS（此液体可长期保存）。

以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入RIPA中。

8.110mg/mlPMSF异丙醇溶液（用量为10?l/ml）
8.2Aprotinin（Sigma产品，用量为30?l/ml）
8.31000mMsodiumorthovanadate冷冻液
（用量为10?l/ml）
9、BlottoA：
常规使用1×PBS，5%milk，0.05%Tween20。

10、BlottoB：
与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，1%milk，0.05%Tween20。

部分实验中milk可完全去除，但可能引起背景增高。

目的：配制500ml的50mg/ml氨苄青霉素贮存液。

实验用品的准备：足够量的2ml的EP管，滤头（内装有两层滤膜）、两个50ml的离心管、注射器，以上用品除注射器外都要进行高压灭菌；
注意：
（1）滤头灭菌前，安装滤膜时，不要旋得太紧，待灭菌后使用前于超净台上用力旋紧，以防漏液。

（2）EP管，滤头、两个50ml的离心管灭菌后要进行烘干。

抗生素溶液的配制：
（1）称取25g的氨苄青霉素粉末，倒入盛有200—300ml去离子水的烧杯中，最好在烧杯上面盖个东西（封口膜或者干净的滤纸），以防止粉末飘出，轻摇烧杯，可见氨苄青霉素粉末迅速溶解。

（2）待氨苄青霉素粉末溶解完，加去离子水至500ml，稍等几分钟让粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。

氨苄青霉素溶液的过滤除菌及分装：
（1）取出旧报纸包裹的滤头，用力旋紧，备用。

（2）用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤头安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至50ml的离心管中，直至把两个离心管都注满。

注意：动作用缓和，一只手拿着活塞，一只手拿着滤头，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。

（3）把50ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到2ml的EP管中。

（4）重复（2）、（3）直至把500ml溶液分装完毕。

（5）在EP管上做好标记，包括名称、日期等。

（6）把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。