层析分离纯化技术
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层析分离纯化技术
2001.11.28 Shanghai Pudong
1
蛋白质纯化策略
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
融合蛋白质
更高纯度
多步纯化
粗提 中度纯化 精细纯化 表达
三步纯化策略
非融合蛋白质
2
简易纯化选择
载体和标记
pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶 PQE 6 x 组氨酸 pET 6 x组氨酸 pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区
检测方法
使用抗-GST 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
MAbTrap™ GII (HiTrap Protein G column (1 ml), 工具, 浓缩缓冲液) HiTrap IgY HiTrap IgM
立即可用的 HiTrap 柱
24
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (3/3)
应用： 应用：基团特异填料
白蛋百, 多种核酸依赖酶, 凝血因子, DNA 结合蛋白, α2-巨球蛋白 外露氨基酸: His (Cys, Trp) 的蛋白和多肽 e.g. α2-巨球蛋白和干扰素 生物素和含生物素物质 凝血因子, 脂蛋白酶， 胆固醇受体, 激素, DNA结合蛋白, 干扰素,蛋白质合成因子 活化好的亲和柱自行挂上配基 偶连一级氨基
3
GST 融合蛋白的纯化
Glutathione Sepharose™
Mr 26 000
GST
重组蛋白
10C
酶切位点 Factor Xa: Thrombin: PreScission™ Protease: Mr 17-20 000 / 28-30 000 Mr 37 000 Mr 46 000
4
任何规模纯化都比较简单
• 立即可用 50 预装柱含缓冲 立即可用, 液和所需试剂 • 可纯化每柱 400 µg, 体积达 400 µl 样品
6
GSTrap™ 柱
适合快速和重复性高的要求
• 20 分钟内 • 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统 使用针筒，蠕动泵， • 添加剂兼容
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
12
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒 孔板
• 快速酶测定 • 每块板可检测 50 样品 • 适合筛选表达系统和层析组 份
13
(His)6 融合蛋白的纯化和检测
Ni2+ Ni2+ His His His Ni2+ Ni2+ His His His
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
立即可用, 预装柱 含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液
HiTrap Chelating 5 ml Chelating Sepharose™ Fast Flow
〈 60 mg 〈 12 mg/ml
立即可用, 预装柱 自行装填到空柱和放大用
纯化
GST MicroSpin™ Purification Module, GSTrap™, Glutathione Sepharose™ Fast Flow His MicroSpin Purification Module HisTrap™, HiTrap™ Chelating, Chelating Sepharose Fast Flow IgG Sepharose 6 Fast Flow IgG Sepharose 6 Fast Flow
9
GSTrap 1 ml 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 PBS, pH 7.3 50 mM Tris™-HCl, pH 8.0 ＋ 10 mM 还原谷胱甘肽 1 ml/min 4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) ÄKTA™explorer 10 % Elution buffer 100
15
His MicroSpin™ 纯化模组
适合蛋白质扩增系统的筛选和优化， 适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化
• 立即可用 50 预装柱连缓冲液 立即可用, 和试剂 • 每柱可纯化达 100 µg, 体积达 400 µl 样品
16
HisTrap™ Kit
快速， 快速，重复性好和容易使用
• 每根 HiTrap™ Chelating 金属螯合柱 可在少於 25 分钟中纯化 12 mg 融合蛋 白 • 包含所需浓缩缓冲液和工具
10
GST 融合蛋白的检测
检测方法
GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒
注意
适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用
GST 酶测定检测模组 功能测定
快速测定；适合筛选用途 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需要自行设计和优化
11
GST融合蛋白的检测 融合蛋白的检测
预装柱
HiTrap Blue
HiTrap Chelating
HiTrap Streptavidin HiTrap Heparin
HiTrap NHS-activated
立即可用的 HiTrap 柱
25
其他融合 或 非融合蛋白的纯化
制作一支特异亲和纯化柱
• 准备配基 (e.g. 抗体 抗体) • 准备柱子 (e.g. NHS-activated HiTrap™) 现成方法 • 优化结合和洗脱条件 • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统操作的 使用针筒，蠕动泵， HiTrap 小柱
重组蛋白
14
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料 预装柱 填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
注意
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品)
Wash 2.7 mg pure GST fusion protein
SDS PAGE analysis
1: 2: 3: 低分子量标记 (LMW) Calibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech 胞浆萃取液, 1 g /10 ml 洗脱GST 融合蛋白
26
其他融合 或 非融合蛋白的检测
SDS-PAGE 免疫印迹 MS Native PAGE IEF MS 生物活性 N-端测序 端测序 分子大小 蛋白质酶切
A 280 0.5 0.60 0.70 1.0
kDa 94.0 67.0 43.0 20.1 14,4
1: 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8:
1 2 3 4 5 6 7 8
低分子量标记 (LMW) 样品稀释 1:20 穿透稀释 1:10 冲洗液 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:20 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:10 GST 标准品, 0.5 mg/ml LMW
应用
抗体分离 所有来源的 IgG，其亚族，和片断 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A
预装柱
包括人源IgG3 ，小鼠 IgG1和大鼠 IgG 的 IgG，其亚族，和片断
HiTrap Protein G
腹水，血请，体液，和细胞培养液的 单克隆和多克隆 IgG 鸡蛋请的 IgY 单克隆和人源 IgM
• 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 使用针筒，蠕动泵， 系统 • 添加剂兼容
17
HiTrap™ Chelating
准备柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗 用洗脱缓冲液 洗脱融合蛋白
用平衡缓冲液平衡柱子
加样 用平衡缓冲液冲洗 柱子
3 min
3 min
5-15 min
2 min
0.0 5.0 10.0 15.0 Flo w through W ash Eluted pool 0.0 A 405
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10
20.0
Volume (ml)
加样
结合液
洗脱液
结合液
19
SDS PAGE
Chelating Sepharose™ Fast Flow
21
检测 (His)6 融合蛋白
检测方法
使用抗-His 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 (His) 6 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
10 - 12 mg 50 - 60 mg 8 mg / ml 10 -12 mg / ml
立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
5
GST MicroSpin™ Purification Module
适合蛋白质扩增系统筛选和优化， 适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化
废液
废液
收集
收集组份
18
HiTrap™ Chelating
样品: 样品 柱: 5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶， GST-(His)6 HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+
A 280 A 405
结合缓冲液: 结合缓冲液 1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脱缓冲液: 洗脱缓冲液 1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4 流速: 流速 结果: 结果 2 ml/min, 312 cm/h 洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg
7
GSTrap™
结合缓冲液平衡 加样后用结合缓冲液冲洗 用洗脱缓冲液洗脱
3 min
5-15 min
2 min
废液
收集
收集组份
8
GSTrap™
柱: 样品: 样品 结合缓冲液: 结合缓冲液 洗脱缓冲液 流速: 流速 层析 步骤: 步骤 系统: 系统 A 280 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5.0 5.0 10.0 10.0 15.0 15.0 20.0 20.0 ml min
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
22
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (1/3)
• 如果有对应配基，使用亲和层析 如果有对应配基， − 一步纯化 − 高灵敏度 − 高载量
23
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (2/3)
适合自行装柱和放大
• 每毫升填料可纯化高达 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化系统 连接使用 • 高流速 • 兼容添加剂
20
检测 (His)6 融合蛋白
检测方法
ELISA 测定＋标记 IgG 功能测定
注意
高特异性，只检测 (His)6 融合蛋白 可有效评估纯化出来的 (His)6 融合蛋白是否具备 活性 不一定能买到 可能需要自行设计和优化
预装柱/填料 预装柱 填料 一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
注意
GST MicroSpin™ Purification Module
立即可用, 预装柱, 缓冲液Biblioteka Baidu试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品)
GSTrap™ 1 ml GSTrap 5 ml Glutathione Sepharose™ 4B Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
Elution buffer
kD
94 67 43 30
80 60 40 20 0
20.1 14.4
1
2
3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化 系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等 兼容尿素，
2001.11.28 Shanghai Pudong
1
蛋白质纯化策略
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
融合蛋白质
更高纯度
多步纯化
粗提 中度纯化 精细纯化 表达
三步纯化策略
非融合蛋白质
2
简易纯化选择
载体和标记
pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶 PQE 6 x 组氨酸 pET 6 x组氨酸 pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区
检测方法
使用抗-GST 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
MAbTrap™ GII (HiTrap Protein G column (1 ml), 工具, 浓缩缓冲液) HiTrap IgY HiTrap IgM
立即可用的 HiTrap 柱
24
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (3/3)
应用： 应用：基团特异填料
白蛋百, 多种核酸依赖酶, 凝血因子, DNA 结合蛋白, α2-巨球蛋白 外露氨基酸: His (Cys, Trp) 的蛋白和多肽 e.g. α2-巨球蛋白和干扰素 生物素和含生物素物质 凝血因子, 脂蛋白酶， 胆固醇受体, 激素, DNA结合蛋白, 干扰素,蛋白质合成因子 活化好的亲和柱自行挂上配基 偶连一级氨基
3
GST 融合蛋白的纯化
Glutathione Sepharose™
Mr 26 000
GST
重组蛋白
10C
酶切位点 Factor Xa: Thrombin: PreScission™ Protease: Mr 17-20 000 / 28-30 000 Mr 37 000 Mr 46 000
4
任何规模纯化都比较简单
• 立即可用 50 预装柱含缓冲 立即可用, 液和所需试剂 • 可纯化每柱 400 µg, 体积达 400 µl 样品
6
GSTrap™ 柱
适合快速和重复性高的要求
• 20 分钟内 • 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统 使用针筒，蠕动泵， • 添加剂兼容
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
12
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒 孔板
• 快速酶测定 • 每块板可检测 50 样品 • 适合筛选表达系统和层析组 份
13
(His)6 融合蛋白的纯化和检测
Ni2+ Ni2+ His His His Ni2+ Ni2+ His His His
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
立即可用, 预装柱 含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液
HiTrap Chelating 5 ml Chelating Sepharose™ Fast Flow
〈 60 mg 〈 12 mg/ml
立即可用, 预装柱 自行装填到空柱和放大用
纯化
GST MicroSpin™ Purification Module, GSTrap™, Glutathione Sepharose™ Fast Flow His MicroSpin Purification Module HisTrap™, HiTrap™ Chelating, Chelating Sepharose Fast Flow IgG Sepharose 6 Fast Flow IgG Sepharose 6 Fast Flow
9
GSTrap 1 ml 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 PBS, pH 7.3 50 mM Tris™-HCl, pH 8.0 ＋ 10 mM 还原谷胱甘肽 1 ml/min 4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) ÄKTA™explorer 10 % Elution buffer 100
15
His MicroSpin™ 纯化模组
适合蛋白质扩增系统的筛选和优化， 适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化
• 立即可用 50 预装柱连缓冲液 立即可用, 和试剂 • 每柱可纯化达 100 µg, 体积达 400 µl 样品
16
HisTrap™ Kit
快速， 快速，重复性好和容易使用
• 每根 HiTrap™ Chelating 金属螯合柱 可在少於 25 分钟中纯化 12 mg 融合蛋 白 • 包含所需浓缩缓冲液和工具
10
GST 融合蛋白的检测
检测方法
GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒
注意
适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用
GST 酶测定检测模组 功能测定
快速测定；适合筛选用途 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需要自行设计和优化
11
GST融合蛋白的检测 融合蛋白的检测
预装柱
HiTrap Blue
HiTrap Chelating
HiTrap Streptavidin HiTrap Heparin
HiTrap NHS-activated
立即可用的 HiTrap 柱
25
其他融合 或 非融合蛋白的纯化
制作一支特异亲和纯化柱
• 准备配基 (e.g. 抗体 抗体) • 准备柱子 (e.g. NHS-activated HiTrap™) 现成方法 • 优化结合和洗脱条件 • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统操作的 使用针筒，蠕动泵， HiTrap 小柱
重组蛋白
14
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料 预装柱 填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
注意
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品)
Wash 2.7 mg pure GST fusion protein
SDS PAGE analysis
1: 2: 3: 低分子量标记 (LMW) Calibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech 胞浆萃取液, 1 g /10 ml 洗脱GST 融合蛋白
26
其他融合 或 非融合蛋白的检测
SDS-PAGE 免疫印迹 MS Native PAGE IEF MS 生物活性 N-端测序 端测序 分子大小 蛋白质酶切
A 280 0.5 0.60 0.70 1.0
kDa 94.0 67.0 43.0 20.1 14,4
1: 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8:
1 2 3 4 5 6 7 8
低分子量标记 (LMW) 样品稀释 1:20 穿透稀释 1:10 冲洗液 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:20 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:10 GST 标准品, 0.5 mg/ml LMW
应用
抗体分离 所有来源的 IgG，其亚族，和片断 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A
预装柱
包括人源IgG3 ，小鼠 IgG1和大鼠 IgG 的 IgG，其亚族，和片断
HiTrap Protein G
腹水，血请，体液，和细胞培养液的 单克隆和多克隆 IgG 鸡蛋请的 IgY 单克隆和人源 IgM
• 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 使用针筒，蠕动泵， 系统 • 添加剂兼容
17
HiTrap™ Chelating
准备柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗 用洗脱缓冲液 洗脱融合蛋白
用平衡缓冲液平衡柱子
加样 用平衡缓冲液冲洗 柱子
3 min
3 min
5-15 min
2 min
0.0 5.0 10.0 15.0 Flo w through W ash Eluted pool 0.0 A 405
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10
20.0
Volume (ml)
加样
结合液
洗脱液
结合液
19
SDS PAGE
Chelating Sepharose™ Fast Flow
21
检测 (His)6 融合蛋白
检测方法
使用抗-His 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 (His) 6 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
10 - 12 mg 50 - 60 mg 8 mg / ml 10 -12 mg / ml
立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
5
GST MicroSpin™ Purification Module
适合蛋白质扩增系统筛选和优化， 适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化
废液
废液
收集
收集组份
18
HiTrap™ Chelating
样品: 样品 柱: 5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶， GST-(His)6 HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+
A 280 A 405
结合缓冲液: 结合缓冲液 1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脱缓冲液: 洗脱缓冲液 1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4 流速: 流速 结果: 结果 2 ml/min, 312 cm/h 洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg
7
GSTrap™
结合缓冲液平衡 加样后用结合缓冲液冲洗 用洗脱缓冲液洗脱
3 min
5-15 min
2 min
废液
收集
收集组份
8
GSTrap™
柱: 样品: 样品 结合缓冲液: 结合缓冲液 洗脱缓冲液 流速: 流速 层析 步骤: 步骤 系统: 系统 A 280 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5.0 5.0 10.0 10.0 15.0 15.0 20.0 20.0 ml min
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
22
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (1/3)
• 如果有对应配基，使用亲和层析 如果有对应配基， − 一步纯化 − 高灵敏度 − 高载量
23
其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (2/3)
适合自行装柱和放大
• 每毫升填料可纯化高达 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化系统 连接使用 • 高流速 • 兼容添加剂
20
检测 (His)6 融合蛋白
检测方法
ELISA 测定＋标记 IgG 功能测定
注意
高特异性，只检测 (His)6 融合蛋白 可有效评估纯化出来的 (His)6 融合蛋白是否具备 活性 不一定能买到 可能需要自行设计和优化
预装柱/填料 预装柱 填料 一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
注意
GST MicroSpin™ Purification Module
立即可用, 预装柱, 缓冲液Biblioteka Baidu试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品)
GSTrap™ 1 ml GSTrap 5 ml Glutathione Sepharose™ 4B Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
Elution buffer
kD
94 67 43 30
80 60 40 20 0
20.1 14.4
1
2
3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化 系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等 兼容尿素，