中空纤维技术以及应用简介

纤维素材质
Cellulose 纤维素 H H H OH
O H
H
n
Cellulose Triacetate 醋酸纤维素
CH2OCOCH3 OCOCH3 n
Regenerated Cellulose (RC) 再生纤维素 CH2OH
OCOCH3
HO
OH
n
根据膜孔径分类
微滤膜结构
超滤膜结构
Skin (5 µm)
Pump
内容
膜分离技术的基本概念
切向流过滤技术的优化
中空纤维的应用举例 中空纤维膜分离产品 总结
GE可提供种类最全的中空纤维产品
• • 超滤： 微滤:
1 KD; 3 KD; 5 KD; 10 KD; 30 KD; 50 KD; 100 KD; 300 KD; 500 KD; 750 KD
0.1 mm; 0.2 mm; 0.45 mm; and 0.65 mm
膜孔径大小的优化选择
Membrane Rejection Curves 100 Sharp Rejection %
Diffusive
Ideal
0 1 10 NMWC (KD) 100
膜孔径选择基本原则
• 样品透过:膜孔径至少为目标分子量的5-10倍以上 - (CHO细胞培养液澄清过滤, e.g. 0.2-0.45 μm HF 抗体) • 样品截留:膜孔径大小应该为目标分子量的1/3-1/5
Bioreactor
Ultrafiltration or microfiltration Cartridge
The permeate or the retentate may be the product. Feed
Filtrate, permeate, or ultrafiltrate Feed pressure
MabSelect Sure捕获
病毒灭活与去除 Capto Adhere精细纯化 50kD膜包浓缩/洗滤（换缓冲液） 0.2µm NFF除菌过滤 注射用抗体
中空纤维一步澄清
0.2/0.45µm
Retentate Membrane
• 开放式结构可直接处理细胞培养 液，无需预处理
Feed
Permeate
Sepharose 6FF RNA-removal
中空纤维的应用
细胞灌注培养
中空纤维膜进行连续灌注培养
Retentate return or recycle stream carries retentate, concentrate or rejects.
Fresh media or air
Backpressure valve Outlet or retentate pressure
中空纤维膜的保存
PES and PS 膜: 用NaOH溶液, 避免用有机溶剂,比如 EtOH等 醋酸纤维素膜:用20% EtOH，避免用NaOH
长时间储存: 推荐冷库保存
Storage Solutions Water NaOH @ RT NaOH @ 4oC Concentrations 0.1M 0.05-0.1M Max. Storage Time 1-3 days 3 months 1 year
750kD /0.1µm中空纤维
特点：
开放式孔道可处理较脏的料液 不需要离心/预过滤 设备投资少，步骤简单快速 完全代替离心机 寿命长，成本低 易于线性放大
5psi
发酵液 P P
P P P P
10psi
菌体收集 (胞内蛋白、质粒) 包涵体收集(重组蛋白) 硫酸铵沉淀收集(重组蛋白)
菌体裂解液澄清
• 可以截留住细胞以及细胞碎片, 蛋白可以顺利透过膜 • 膜孔径选择750k/0.1µm/0.2µm
大孔隙结构
Support (100 µm)
Skin (3 µm)
无大孔隙结构
Support (100 µm)
根据过滤原理分类
Feed Flow
死端过滤
• 过程控制简单 • 用于溶液预处理，除菌 • 用于低浓度样品的处理 • 膜载量较低
Flow Pressure
Filtrate Flow
Time
根据过滤原理分类
内容
膜分离技术的基本概念
切向流过滤技术的优化
中空纤维的应用举例 中空纤维膜分离产品 总结
中空纤维的应用
菌体收集、菌体裂解液澄清
高固含量料液的固液分离
胞内可溶蛋白的纯化
发酵
菌体收集/清洗
细胞破碎/裂解
培养基去除/浓缩
裂解液澄清 层析纯化 ……
纯化的蛋白
细胞碎片去除
菌体收集 : 酵母, E.Coli, Insect cell等
750kD浓缩（浓缩50-100倍/洗滤）
4FF/6FF凝胶过滤（精纯）
Q Sepharose FF离子交换（穿透式，可选）
750kD膜超滤浓缩
Formulation
纯化的病毒疫苗
流脑多糖疫苗浓缩
FlexStand 中试规模：UFP-50-E-6A, 0.28m2
HF 50k mg唾液酸/g粗糖 (>400) 437
中空纤维技术以及应用简介
Yang Chao ( 杨超), GE Product Specialist
1391-184-5817 2012.08.09
内容
膜分离技术的基本概念
切向流过滤技术的优化
中空纤维技术的应用举例 中空纤维膜分离产品 总结
膜分离技术的定义及原理
滤膜：多孔的高分子聚合物制成的一层或多层的薄膜状物质;
- (蛋白浓缩/缓冲液置换, e.g. 50-100kD MW抗体的浓缩) • 两种物质需要用膜技术分开, 分子量10倍的差异.
切向流过滤参数的优化
TMP (tans-membrane pressure) 透膜压力= (PF+PR)/2-PP
TMP ∝ Flux (一定范围内正相关，LMH)
Delta P = PF-PR Delta P ∝ Cross flow（循环流速）∝剪切力（shear rate）
Buffer Concentration (%)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Diafiltration Volume (DV)
中空纤维膜的清洗
化学试剂: 以NaOH试剂为主（0.1-1M NaOH） 适当添加部分清洗剂 清洗时间: 30min--2hr 清洗温度: 25oC--50oC, 更高的温度可以更容易去
•菌体／细胞/澄清/收集/分离/去除
透过端控制 ( PFC, permeate flow control )
1 psi
Crude culture P P
PFC
Allows for PFC and a steadier flux
Permeate Flux
Unrestricted Permeate Flow Permeate Flow Control (PFC)
除污染物中的一些脂蛋白
循环流速度: 等同或者超过操作的循环流速的50%
膜清洗结果例证
Challenge protein solution used for this study: 0.5% or 1% BSA
Cleaning Methods 0.5M NaOH for 30min at room temperature 1M NaOH for 2hrs at 50oC 0.5M NaOH-300ppm NaOCl for 30min at room temperature 0.5M NaOH for 30min at room temperature then 0.5M H2SO4 for 30min at room temperature 0.5M NaOH-500ppm NaOCl for 30min at room temperature Double 0.5M NaOH-300ppm NaOCl for 30min at room temperature Water Flux Recovery >62% >65% >80% >84% >90% ~100%
Cross Flow
切向流过滤
• 过程控制复杂（过膜压力， 切向流流速） • 用于培养液收集，样品浓 缩以及交换缓冲液 • 较高的膜载量
Flow Pressure
Permeate Flow
Time
中空纤维的组成
中空纤维切向流过滤装置示意图
内容
膜分离技术的基本概念
切向流过滤技术的优化
中空纤维的应用举例 中空纤维膜分离产品 总结
透过端
入口端 Feed
回流端 Retentate
超滤过程的优化
超滤应用：
•浓缩/换液
•除去小分子
•部分用于收集细胞以及菌体
Optimal TMP 最佳透膜压力
Filtrate Flux (LMH)
Membrane Control Region
Gel Layer Control Region
Water
• 低剪切力防止聚集
• 高载量可重复使用，成本低 • 可在位清洗防止污染 • 线性放大
Crude culture
P P
PFC
2psi
P P P P
Clarified culture
6 psi
膜孔径选择结果
Cross Flow
Permeate Flow
洗滤体积的选择
120 105 105 90
Recovery %
2psi
P P
P P
Clarified culture
Time
6 psi
PFC vs Unrestrict Permeate Flow
洗滤过程的优化
优化洗滤方法
直接稀释法 间断稀释法 连续流稀释法
wk.baidu.com
洗滤方法的选择
100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 0 1 dilution Discoontinous Continuous
Sample Solution
Optima TMP Region TMP (psi)
TMP 优化
Optimal TMP Permeate Flux
Higher Crossflow
Lower Crossflow
Optimal TMP
TMP
微滤过程的优化
微滤应用：
•除菌／除颗粒 •发酵液培养液澄清
•连续细胞培养灌注
•
•
纤维管内径:
单根滤柱膜面积：16cm2-28m2
0.25 mm; 0.5 mm; 0.75 mm; 1.0 mm; 1.75 mm; 2.0 mm; and 3.0 mm
S_30k Cassette
440
Flux通量(LMH)
处理量 (L/m2) mg核酸/g粗糖 (2030) EU内毒素/g粗糖
33
89 < 10
25
33 13
(<300)
CWF recovery
括号内为 IPC内控指标
W群流脑多糖疫苗
228
> 95%
249
ND
超螺旋质粒DNA疫苗纯化
Fermentation
750K HF cell harvesting
Lysis Cheesecloth 20um NFF
300k HF concentration
Formulation
Source 30Q 300K HF polishing concentration
PlasmidSelect Xtra supercoiled plasmid DNA capture
• 750kD HF 流感疫苗浓缩/洗滤
• 50kD 流脑多糖疫苗浓缩/洗滤 • 300kD HF 腺病毒的浓缩/洗滤
• 300kD HF 乙肝疫苗浓缩/洗滤
• 300kD HF DNA疫苗浓缩/洗滤
通用病毒疫苗生产工艺（狂犬、流感等）
传代Vero或BHK21细胞培养/原代地鼠肾细胞
1-2µm死端过滤（澄清）
膜分离：利用滤膜将目标物分开的一种物理操作方法.
流体
滤膜
流体
有机合成膜
Polysulfone (PS) 聚砜 O O S O O CH3 C CH3 n
Polyethersulfone (PES) 聚醚砜 O O S O n
Polyvinylidene Fluoride (PVDF) 聚偏氟乙烯 H C H F C F n
A. 胞内可溶蛋白 HF UFP 缓冲液置换 HF 沉淀收集 HF UFP 去除戊二醛 HF 缓冲液置换
P P P P
1psi
发酵液 P P
硫酸铵蛋白沉淀
戊二醛解毒
2psi
B. 包涵体收集(重组蛋白) HF 柱上复性
6psi
中空纤维的应用
细胞培养液澄清 (MAbs)
抗体整体下游分离过程
高密度细胞培养液 中空纤维微滤一步澄清
92 65 64
75 60 45 30
25 15 6 11 3.5 5
V3
15 0
te V1
2.5 2
V4
1.5
V5 ol D V1 -4 po
rm ea
D
D
V2
D
D
pe
D Pe rm ea te +
Exp 2 Exp 1
中空纤维的应用
浓缩、洗滤 (Vaccine)
经典应用案例： • 750kD HF 狂犬疫苗浓缩/洗滤