实验5琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
(自改)酶的竞争性抑制作用
本实验中5号、6号试管的作用是什度。
注意随时观察各管褪色情况。 37℃水浴保温过程中，不能振摇试管，避免 甲烯白重新氧化变蓝。
实验结束后，一定要洗净试管内的液体石蜡。
生物化学与分子生物学实验 CQMU
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用
P、97
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
目的： P、97
原理：1、概念：丙二酸（I）与琥珀酸（S）结构相似，竞争结合 琥珀酸脱氢酶活性中心，抑制酶活性。 2、竞争性抑制特点： P、98 ① Vm不变，Km ↑ ；
② E 的抑制程度
3. 结果及分析
试管编号 1 2 3 4 5 6
各管均在最后加入琥珀酸。并且立即混匀， 沿管壁加入石蜡油约0.5 cm厚，37 ℃水浴保温 （不摇动）。随时观察记录褪色所需时间
计算各管[I]/[S]
完全褪色 所需时间
P.99 酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？
各管的褪色情况有何区别？为什么？ 丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型及其特点是什么？
∝ [I]/[S]
；
③ [S]足够大，抑制解除。 3、观察： 操作：1、酶提取液的制备 2、取试管6支，按表所列步骤操作。 3、实验结果及分析 注意事项 ：
一、实验目的
学习和掌握酶竞争性抑制的概念和特点 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑 制作用
二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物的结构相似，可 与底物竞争酶的活性中心，阻碍 酶-底物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
● Km和Vmax的求法 底物浓度曲线是双曲线。
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
实验5-琥珀酸脱氢酶 ALT
分光光度计的使用
波长 样品池 读数 拉杆， 档 拉杆，1-4档 1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管）， 模式调 ），T模式调 档 空白管）， 模式调100%，显示“Blank”、 ，显示“ 、 “100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式下调 ，显示“0.00” 拉杆拉至 档 模式下调0%，显示“ 模式下调 4. 换到 模式，拉至 、3、4档，读取各个样品的吸光度 换到A模式 拉至2、 、 档 模式， 、分清光面、毛面。手应接触毛面， 比色杯 1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过 2、用溶液润洗 次，装至 至4/5体积 、用溶液润洗2-3次 装至2/3至 体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 、粗纸吸水、 毛面 光面
血清谷血清谷-丙转氨酶活性单位
在pH 7.4、37℃条件下， 、 ℃条件下， 每毫升肝匀浆与底物保温30min后， 后 每毫升肝匀浆与底物保温 每生成2.5 µg的丙酮酸作为 每生成 的丙酮酸作为 1个谷 丙转氨酶的活性单位， 个谷-丙转氨酶的活性单位 个谷 丙转氨酶的活性单位， 血清中GPT正常值为 正常值为2-40 U/mL。 血清中 正常值为 。
实验7
【实用】琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制PPT文档
试剂
pH7.4磷酸缓冲液 0.5%草酸钠溶液 生理盐水
0.25%琥珀酸钠溶液 0.01%甲稀兰溶液
实验操作
肝糜液的制备： 用颈椎脱臼法处死小白鼠，立即剖腹将肝脏 全部取出，用生理盐水洗净肝脏，充分研碎 至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边 加边磨，总共加入7ml，搅拌后离心约5分 钟（3000rpm）,将上清液倒入另一试管钟 备用，此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。
2利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制特点 是什么？
时间，并进行分析。 制的程度。
草酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
（用天平精密平衡离心管和它们的内容物，若有套筒，离心管应与套筒一起平衡，否则轻者造成离心机损坏，重者会引起人员伤亡）
（平衡后应对称放置，不能错位，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴）
25%琥珀酸钠溶液 0.
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
制作人：胡森 吴启星 谢金芳 李红丽 王婵
实验目的：
学习动物的处死与组织匀浆的方法 学习离心机的使用方法 进一步理解酶的竞争性抑制原理
实验原理：
竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制 剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制 酶的活性。竞争性抑制剂的抑制程度取决于 抑制剂与酶的亲和力及于底物的相对比例。
另取5支试管，标号，按下表操作
肝糜液的制备：
用颈椎脱臼法处死小白鼠，立即剖腹将肝脏全部取出，用生理盐水洗净肝脏，充分研碎
至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml，搅拌后离心约5分钟（3000rpm）,将上清液倒入另一试管钟备用，
试剂 1号管 2号管 3号管 4号管 5号管 此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。
0.2
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。
抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。
如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。
反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。
琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。
肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。
因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。
二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。
3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制目的与要求：了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验原理：肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。
反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。
丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
操作步骤：酶提取液的制备酶促反应管的制备37℃酶促反应，观察甲烯蓝褪色程度实验结果：间隔10分钟，记录各管甲烯蓝褪色程度，解释结果。
注意事项：充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗。
滴加液体石蜡时，倾斜试管，避免产生气泡。
观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。
改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性目的与要求：了解Mohum法测定谷-丙转氨酶活性的原理及测定方法实验原理：利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用2 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色的丙酮酸二硝基苯肼，在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。
血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug 的丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。
实验步骤：见书Page 77酶活性测定表格。
实验结果：谷丙转氨酶活性单位A测定管/A标准管标准管中丙酮酸含量10/2.5。
注意事项：保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境。
酶活性单位。
微量移液器的使用。
..。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。
SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。
SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。
竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。
实验的结果可能呈现出以下几个情况：抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。
实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度（IC50）,进而评价抑制剂的效果。
在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。
这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。
从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。
实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。
在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。
这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。
实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇36室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。
2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。
琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。
（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。
在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。
2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。
酶的竞争性抑制作用
各管置于37℃水浴箱中保温10-15分钟，随时观察各管的颜
色变化并记录结果。
管 号
1 2 3 4
七、注意事项
1、加试剂前一定要将试管清洗干净
2、加入液体石蜡后就不要再摇动试管。避免 空气中的氧接触反应溶液，使得还原型的甲 烯白重新氧化成蓝色 3、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各 试管的褪色情况
一、实验目的
1、通过实验证明组织中存在琥珀酸脱氢酶 2. 验证丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
* 竞争性抑制的特点 (1) I 与 S结构类似，竞争酶的活性中心 (2) E 既可以结合 S 也可以结合 I, 但是不能同时结 合两者 (3) I 与 E的活性中心结合后, E 分子失去催化活性 (4) 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及 底物浓度
CH CH COOH
延ห้องสมุดไป่ตู้索酸
+
MBH 2
还原性亚甲蓝（无色）
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争
性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察在由不
同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体
系中使等量亚甲蓝退色的程度，从而鉴
定丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用和
抑制程度。
当抑制剂浓度较低时
随着抑制剂浓度的增高
当抑制剂浓度高达一定程度
二、实验原理 竞争性抑制作用
琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延
胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。本实验 用亚甲蓝（MB）作为受氢体，蓝色亚甲蓝 接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的 甲烯白（MBH2）。
COOH CH2 CH2 COOH
琥珀酸 亚甲蓝（蓝色）
COOH + MB
琥珀酸脱氢酶 丙二酸（-）
六、实验结果
琥珀酸脱氢酶竞争性实验设计方案
1.酶的提取液的制备：将大白鼠处死，取骨骼肌， 切成碎片后，放入研钵中，每组取8g左右，加入 1/15mol/L的Na2 HPO4溶液5ml研成糊状后，再加 入5ml1/15mol/L的Na2 HPO4溶液，混匀后，用纱 布过滤，用干净的烧杯收集备用。
2.取试管5支，按照下列表格操作：
3.各管混匀后，沿试管的内壁加入石蜡油（隔绝空 气），放置到37℃水浴中保温，观察各管甲烯蓝的 褪色情况，并记录褪色的所需要的时间，解释其现 象。
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气 对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要 产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧 气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。 4.、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色 情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。
各管混匀后沿试管的内壁加入石蜡油隔绝空气放置到37水浴中保温观察各管甲烯蓝的褪色情况并记录褪色的所需要的时间解释其现1酶提取液的制备应操作迅速以防止酶活性降低
1. 掌握竞争性抑制的概念和特点。 2. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 3. 分析实验现象。
• 化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争 结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制 作用称为竞争性抑制作用。琥珀酸脱氢酶其辅基为FAD， 如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱 氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色 的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。 丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和 琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则 不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相 对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
三、实验步骤：
标准管法测定酶活性：
1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管
2、依次加入试剂，混匀，37℃保温 3、呈色反应后，520nm比色测OD值
P77页
四、结果：
谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆=
五、注意事项：
1 、保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥 催化作用环境要一致。
2. 试剂滴加时，看清剂量，滴加液体石蜡时沿 着管壁倾斜加入。
3. 观察结果时不能振摇试管！避免甲烯白重新 氧化变蓝。
（Page 76） 实 验
二十二
改良Mohum法测定
鼠肝谷-丙转氨酶活性
一、实验目的
了解谷－丙转氨酶活性测定 的原理及测定方法。
二、实验原理：
丙氨酸+α-酮戊二酸
GPT
谷氨酸+丙酮酸 2、4-二硝基苯肼
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯 蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制 作用。
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备
1g 兔肌肉(剪碎)＋海砂少许 +2mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液（研磨成糊状）,然后再分 两次加10mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液(混匀)。
2 、掌握概念：酶活性单位 3、 微量移液器的使用
分光光度计的使用
1、打开分光光度计，预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。
T档 拉杆0档
调T100% ： 空白管
T档 拉杆1档
调T 0% ：
A档 拉杆2、3、4档 测吸光度： 标准管，测定管
休息状态：拉杆1档
竞争性抑制作用
抑制程度 取决于抑制剂 和底物对酶的 相对亲和力以 及抑制剂和底 物浓度比。
琥珀酸脱氢酶实验报告
一、实验目的1. 理解琥珀酸脱氢酶在细胞代谢中的作用。
2. 掌握琥珀酸脱氢酶的活性测定方法。
3. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
二、实验原理琥珀酸脱氢酶（SDH）是三羧酸循环（TCA循环）中的一个关键酶，其主要功能是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时将脱下的氢传递给电子传递链。
本实验采用比色法测定琥珀酸脱氢酶的活性，通过观察甲烯蓝的脱色时间来反映酶的活性。
丙二酸作为竞争性抑制剂，其化学结构与琥珀酸相似，可以与琥珀酸竞争酶的活性中心，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 大肠杆菌2. 琥珀酸钠3. 甲烯蓝4. 磷酸缓冲液5. 丙二酸溶液6. 液体石蜡实验仪器：1. 试管2. 吸量管3. 电热水浴锅4. 恒温水浴箱5. 移液器四、实验步骤1. 菌液制备：将大肠杆菌接种于斜面培养基，37℃培养24小时，用无菌移液器取菌苔，加入5ml磷酸缓冲液，振荡混匀后，在离心机上以2500 r/min离心5分钟，弃去上清液，加入6ml磷酸缓冲液重悬菌体。
2. 酶活性测定：a. 取试管3支，分别编号为A、B、C。
b. 向A管中加入1ml菌液，B管中加入1ml菌液和1ml丙二酸溶液，C管中加入1ml菌液和1ml磷酸缓冲液。
c. 向各管中加入0.5ml琥珀酸钠和1ml甲烯蓝溶液。
d. 将试管放入恒温水浴箱中，在37℃下保温5分钟。
e. 将各管取出，立即在离心机上以5000 r/min离心5分钟，取上清液。
f. 用分光光度计在波长620nm处测定各管的吸光度值。
3. 计算酶活性：a. 计算A管和C管的平均吸光度值。
b. 计算A管和C管的吸光度比值。
c. 根据标准曲线计算琥珀酸脱氢酶的活性。
五、实验结果与分析1. 通过实验，成功制备了大肠杆菌菌液，并测定了琥珀酸脱氢酶的活性。
2. 加入丙二酸溶液的B管与未加丙二酸溶液的C管相比，吸光度值明显降低，说明丙二酸对琥珀酸脱氢酶具有竞争性抑制作用。
3. 通过计算，得出琥珀酸脱氢酶的活性为X单位。
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【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
2
2
2
0.01%美蓝溶液（滴） 5 5
5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。
在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
在生物体外，可以人为地提供无氧的条件进 行实验，反应中生成的FADH2可使氧化型美蓝 （蓝色）转变成还原型美蓝（无色）。因此，可 以从美蓝的颜色变化观察琥珀酸脱氢酶的作用。
FAD
FADH2
CH2COOH + 美蓝
CH2COOH
琥珀酸脱氢酶
CHCOOH ＋ 美蓝－2H
CHCOOH
琥珀酸
氧化型（蓝色）
延胡索酸
还原型（无色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉
2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
【实验步骤】
1. 制备肌提液（酶液）：取新杀死的动物肌肉 3～5g，加冷的磷酸缓冲液研磨，过滤，低温保 存，备用。
2. 取试管3支，按下表操作。
试剂
试管编号
12
3
肌提液 （ml）
2 2 2（煮沸）
0.02mol/L丙二酸钠 溶液（ml）
—
1
—பைடு நூலகம்
蒸馏水（ml）
1—
1
0.02mol/L琥珀酸钠 溶液（ml）