分子生物学基础PPT第四章

第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物启动子对转录的影响 TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同（图4-5）。 前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或 进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区 突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。研 究SV40晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该 启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5′上 游–21－–47核苷酸序列切除，基因完全不表达（图4-6）。
分子生物学基础
遗传信息的转录—从 第四章 遗传信息的转录 从DNA到RNA 到
第一节 RNA转录的概述
一、RNA转录的特点 RNA转录的特点 在DNA指导下RNA的合成称为转录。RNA链的转 录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终 点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单 位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一 种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶 段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转 录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter）控 制，而控制终止的部位称为终止子（teminator）。 典型的转录单位结构如图4-1。
第四节
转录后加工
图4-12 真核生物mRNA5′–端帽结构
第四节
2．3′–端加尾
转录后加工
真核生物成熟的mRNA 3′–端通常都有100~200个腺苷 酸残基，构成多聚腺苷酸（polyA）的尾巴。通过研究发 现，DNA序列中没有多聚T的序列，由此说明了3′尾巴 polyA是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸 化的信号，该序列AAUAAA，因为切除该保守序列，3′–端 则不能进行切除，也不能形成polyA尾巴。3′–端polyA尾 的形成见图4-13。
第二节 启动子与转录的起始
1．原核生物的启动子结构 原核生物启动子序列按功能的不同可分为3个部位（图4-4上）。 （1）起始部位：指DNA分子上开始转录的作用位点，该位点有与 转录生成RNA链的第一个核苷酸互补的碱基，由前述内容可知，该碱 基的序号为+1。 （2）结合部位：是DNA分子上与RNA聚合酶的核心酶结合的部位， 其长度为7bp，中心部位在–10bp处，碱基序列具有高度何守性，富含 TATAAT 序 列 ， 故 称 之 为 TATA 盒 （ TATA box）， 又 称 普 里 布 诺 序 列 （pribnow box）。因该段序列中富含AT碱基，维持双链结合的氢键 相对较弱，导致该处双链DNA易发生解链，有利于RNA聚合酶的结合。 （3）识别部位：利用诱变技术可使启动子发生突变，当–35序列 突变时，将会降低RNA聚合酶与启动子的结合速度，这说明–35序列提 供了RNA聚合酶识别的信号，该序列的碱基富含TTGACA，其中心则刚 好位于–35bp处，它是RNA聚合酶σ亚基的识别部位。
第三节 转录的终止
二、依赖于ρ因子的终止 依赖于ρ 体外转录实验表明，纯化的RNA聚合酶并不能识别特 异性的转录终止信号，而加入大肠杆菌ρ因子后该聚合酶 就能在DNA模板上准确地终止转录。 ρ因子是一个相对分 子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷 酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生 RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。 依赖于ρ因子的转录终止区DNA序列缺乏共性，说明 该因子并不能识别这些终止位点。现在一般认为，RNA合 成起始以后ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠水解ATP产 生的能量，沿着5′→ 3′方向朝RNA聚合酶移动，到达 RNA的3′-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶， 使之从模板DNA上释放mRNA，完成转录过程（图4-10）。
第三节 转录的终止
图4-11 依赖于蛋白质因子的转录抗终止模式
第四节
转录后加工
一、mRNA的加工 mRNA的加工 1．5′–端帽结构 目前所知5′–端帽结构是在核内完成的，且先于对 mRNA中段序列的剪接过程，加帽的作用部位是转录后的 mRNA 5′–端的第一个核苷酸上。由前面内容所知，RNA 5′–端的第一个核苷酸以嘌呤类多见，尤以pppG为主，其 作用过程为：先由磷酸酶把5′–pppG水解生成5′–pG，然 后与另 一个三磷酸鸟苷pppG反应生成三磷酸双鸟苷，接着在 甲基化酶的作用下，由SAM提供甲基，将甲基连接在后接 上去的鸟嘌呤碱基N7位上，生成5′m7GpppGp，此结构称帽 子结构（图4-12）。
第二节 启动子与转录的起始
图4-4 原核和真核生 物的启生物的启动子结构 科学家通过对许多基因启动子区的分析，发现绝大多 数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。简单地 说，真核基因的启动子（图4-4下）在–25－–35区含有 TATA序列，在–70－–80区含有CCAAT序列（CAAT box）， 在–80~–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。习 – – 惯 上 ， 将 TATA 区 上 游 的 保 守 序 列 称 为 上 游 启 动 子 元 件 （upstream promoter element,UPE）或称上游激活序列 （upstream activating sequence，UAS）。
第二节 启动子与转录的起始
图4-7 原核生物基因转录的起始
第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物转录的起始 除了RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少 还需要7种辅助蛋白质因子参与（表4-3）。因为不少辅助 因子本身就包含多个亚基，所以转录起始复合物的分子量 特别大。 真核生物转录起始过程（图4-8）：在7种辅助因子参 与下，RNA聚合酶与启动子相互作用，聚合酶首先与启动 子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经 过解链得到二元开链复合物。解链区一般在–9－+13之间， 而酶与启动子结合的主要区域在其上游。一旦开链区解链， 酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形 成开链复合物。因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白， 又是单链DNA结合蛋白。DNA开链是按照DNA模板序列正确 引入核苷酸底物的必要条件。
第一节 RNA转录的概述
三、RNA聚合酶 RNA聚合酶 1．原核生物的RNA聚合酶 大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的（表4-1），大肠杆菌 RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个ω亚基组 成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合全酶（holoenzyme）， 相对分子质量为4.65×105（图4-3）。
第二节 启动子与转录的起始
图4-5 启动子区主要顺式作用元件与基因转录活性
第二节 启动子与转录的起始
图4-6 SV40基因启动子上TATAAA及邻近区域对基因 转录活性的影响
第二节 启动子与转录的起始
二、转录的起始 1．启动子区的识别 2．原核生物转录的起始 原核生物转录起始过程（图4-7）：RNA聚合酶在σ亚 基引导下，识别并结合到启动子上，使DNA局部的双链被 解开，形成的解链区称转录泡（transcription bubble）， 解链发生在与RNA聚合酶结合的部位。RNA聚合酶的催化亚 基按照模板链对碱基的选择，特异识别底物核苷酸，形成 磷酸二酯键并脱下焦磷酸，合成RNA链最初2~9nt。第一个 核 苷 酸 通 常 为 带 有 3 个 磷 酸 基 的 鸟 苷 或 腺 苷 （ pppG 或 pppA）。起始合成后，σ亚基脱离核心酶与启动子，起始 阶段至此结束。
第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶 真核生物的基因组比原核生物大，RNA聚合酶也更为复杂。其相 对分子质量大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有Zn2+。利用α鹅膏蕈碱（α-amanitine）的抑制作用可将真核生物RNA聚合酶为分 三类（表4-2）。
第二节 启动子与转录的起始
第三节 转录的终止
一、不依赖于ρ因子的终止 不依赖于ρ 现已查明，模板DNA上存在终止转录的特殊信号—— 终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由 这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点 前面有一段由4~8个A组成的序列，所以转录产物的3′端 为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。在新 生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏 RNA–DNA杂合链5′端的正常结构。RNA3′端寡聚U的存在 使杂合链的3'端部分现不稳定的rU·dA区域。两者共同作用 使RNA从三元复合物中解离出来（图4-9）。终止效率与二 重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少 6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐 步提高。
第一节 RNA转录的概述
3．通过启动子 转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA 聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固， 很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地 合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。 所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。 4．转录延伸 RNA聚酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过 程就是转录的延伸。大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒合成50-90 个核苷酸。随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的 单链DNA模板，新生RNA链的3'末端不断延伸，在解链区形成RNA–DNA 杂合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原先配对的非模板链重 新结合成为双螺旋。 5．转录终止 当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二 酯键，RNA–DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而 RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。
第一节 RNA转录的概述
图4-1 典型的转录单位结构
第一节 RNA转录的概述
二、转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别、 转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止（图4-2）。