质粒复制的调控机制
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3‘ - OH的生成是复制起始的限速步骤, 受反义RNA(RNAⅠ)调控。RNAⅠ序列 与RNAⅡ的前108 碱基序列完全互补, 互补区结合可改变RNAⅡ下游效应位点 的二级结构, 使RNAⅡ的3’ 端不能与模板DNA偶联,RNase H 就不能对RNAⅡ 进行加工, 从而阻断引物的生成, 抑制复制的起始。
Regulation of plasmid copy number by iterons:
Rep 蛋白能以二体形式 结合于启动子区, 反式作 用, 对其合成进行自我调 节;
Rep 蛋白对复制具有双 向调控作用, 且视它的胞 内浓度而定, 当胞内浓度 低时起复制激活剂作用, 胞内浓度高时则起抑制 剂作用。
分离(segregation)机制有关，不能在同一细胞中并 存的质粒是因为他们共享一个或多个共同的复制因 子或相同的分配系统。(对于单拷贝质粒???)
当两种复制及调控机制毫不相干的质粒在同一个细 胞中生存时,它们各自复制,再各自分配到不同的子细 胞中,不会发生干扰。当两种复制及调控机制相关或 相同的质粒在同一个细胞中生存时,质粒复制及调控 机制就会把它们看做成同种质粒而将他们的拷贝数 控制在一定的数目内。由于细胞时质粒在子细胞中 分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后,就会造 成敏感质粒的分离丢失。
严紧型质粒 (Stringent plasmid)
松弛型质粒 (Relaxed plasmid)
拷贝数 分子量
少 (1 ～ 3 个拷贝数) 较大
多 (10 ～ 60 个拷贝数) 较小
复制方式
随细菌染色体的复制同步进行， 独立于细菌染色体而自主复制, 即只在细胞周期的一定阶段进 即在整个细胞周期中随时可以 行复制，当细胞染色体复制一 复制，当染色体复制已经停止
质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。 彼此不相容的质粒 属于同一个不亲和群(incompatiblity group)。而彼此能够共 存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。不亲和群之间的质 粒是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。
质粒不相容性的原因 质粒的不相容性现象主要是与质粒的复制调控和
在随后的细胞生长期间, 这种质粒 对也逐渐分离, 使各质粒分子的复 制起始潜力得以恢复。
⒉ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation)
在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复 制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。
反义RNA : 小RNA 分子, 长35～150 nt, 有1～4个茎-环 ( stem-loop) , 其序列与靶转录物 5' 端的一个区域互补, 又 称反转录RNA( countertranscribed RNA, ctRNA)
质粒复制的调控机制
07制性 质粒复制的调控机制 质粒不相容性(inc, incompatibility)
质粒(plasmid)
质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的 一类核酸分子
绝大多数的质粒是DNA型 目前已知只有酵母杀伤质粒(killer plasmid)是RNA型
质粒不相容性 ( plasmid incompatibility ) 指在没有选择压力的情况下，同种的或亲缘关系相近的
两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象，也称为不 亲和性(inc)。例如colE1衍生质粒，它们之间是互不相容的， 也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一 细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释) 掉。
为Rep A的mRNA 。此外在
RNA-CX 5’ 端还编码Cop B
蛋白,可抑制PA开始的转录。
翻译水平调控: CopA可同 RepA的mRNA 5’ 端部分碱 基序列互补结合,产生位阻效 应阻碍了前导肽基因(tap) 的 翻译, 进而抑制了RepA 的合 成(翻译偶联), 影响质粒复制
四 质粒不相容性
负调控模型 质粒刚移入新宿主时,负调节因子的浓度可忽略不计,
质粒能在短时间内达到正常拷贝数, 然后通过增加或减少 每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝 数(N), 使该菌群中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值(Nav ) 附近的一个很小的波动范围内。
上述控制机制是由质粒自编码的负控制系统通过调控 复制起始率而实现的, 其负控制元件就编码在质粒上。
“手铐”模型 ( “handcuffing”model)
空间位阻模型
空间位阻模型认为, 决定质粒复制 率的主要因素是重复子的浓度而 不是Rep 蛋白的表达水平。当质 粒拷贝数较低时, Rep蛋白与重复 子结合并饱和, 促发复制起始; 随 着质粒拷贝数的增加, 结合于某一 起点重复子的Rep 分子, 开始与结 合于另一起点重复子的Rep 分子 相互作用, 并通过Rep- Rep 相互 作用把2个环状质粒分子偶联起来, 形成“手铐”状的复合物, 导致这 2个重复子区域之间出现空间位阻 而阻断复制的起始。
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⑵ 抑制前导肽翻译
这种作用方式的例子是质粒R1, 它的基本复制子含有可读 框copB、tap 和repA, 分别编码转录阻遏蛋白CopB、前导 肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻译偶联的。 RepA蛋白是复制的限速因子, 以顺式作用, 但不能重复使 用, 其复制控制在转录和翻译两个水平上进行。主控制元 件是RNAⅠ,名为CopA,从repA-mRNA 前导区的一段互补 链转录而来, 长约90 nt。
绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结 构，即cccDNA (covalently close circular DNA )
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
一 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋 予宿主细胞特定的遗传性状.
质粒DNA的复制方式: 主要有“θ”型复制和滚环复制 根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制
INC 的分子生物学基础是质粒的复制调控机制存 在同源性,此外具有相同复制起始位点和分配区的 两种质粒也不能共存于同一个宿主菌
影响INC的主要因素: ⑴ 反义RNA编码区(主要决定区) ⑵ 重复子 ⑶ 复制起始位点 ⑷ 质粒分离机制(segregation system)
Thank you for your attention
次时质粒也只复制一次 时，该质粒仍然能够继续复制。
控制系统 常见质粒
单拷贝控制系统 F质粒, P1质粒
多拷贝控制系统
Col E1质粒(20～30) ; pBR322 (16 copies); pUC (30～50 copies)
二 质粒复制的调控机制
为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控 制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中, 某一质粒的拷贝数(N) 通常是一定的。
类型：
① 严紧型质粒(Stringent plasmid) ② 松弛型质粒(Relaxed plasmid) 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的， 同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型， 这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主 的控制，同宿主的状况有关。
质粒复制类型
⒈ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
在含重复子的质粒复制起点(ori) 中, 有一富AT 区和多个重复 序列(重复子) , 质粒编码的复制起始蛋白Rep 能以有序的方 式与重复子序列结合, 起到控制质粒拷贝数的作用。
在上述模式中,Rep蛋白结合在复制起始区及其附近的重复序 列上,对复制起始起着正调节作用,同时对其自身的表达起负 调节作用。
反义RNA的作用方式主要有以下两种:
⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1质粒为例来说明)
⑵ 抑制前导肽翻译
(以R1质粒为例来说明)
⑴抑制引物RNA 加工
ColE1 质粒的复制起始由一长为700 nt 的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。 RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 经构象变化后, 与模板DNA在复制起始区附近 偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 产生 游离的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 从这个游离的3’ - OH开始DNA前 导链的合成。
现在已知的复制控制方式主要有三类: ⑴ 单一元件控制; ⑵ 主、辅元件控制; ⑶ 2 种控制元件协同作用。
依所用负控制元件的类型不同, 质粒复制的控制系统主要 有: ⑴ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
⑵ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation) ① 反义RNA单独控制 ② 反义RNA 与转录阻遏蛋白共同控制
Regulation of plasmid colE1 copy number by antisense RNA:
控制复制引物与模板的 结合
RNAⅠ的启动子是组成 型的, 故其数量与质粒拷 贝数成正比, 但不稳定。
在ColE1 中还有一个质 粒编码的控制元件Rom 蛋白(又称Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 结合蛋 白, 它能增强RNAⅠ与 RNAⅡ的相互作用, 稳定 RNAⅠ- RNAⅡ复合物, 因而能加强对复制的抑 制作用, 但在上述控制回 路中只起辅助作用。
Regulation of plasmid R1 copy number by antisense RNA:
控制复制起始因子(RepA)与 Ori结合,从而抑制其上游 DnaA蛋白的结合,抑制复制 起始
转录水平调控: 在rep A基因 上游有两个启动子, PO(组成 型)和PA(调节型),分别转录产 生RNA-CX和RNA-A,均可作
Regulation of plasmid copy number by iterons:
Rep 蛋白能以二体形式 结合于启动子区, 反式作 用, 对其合成进行自我调 节;
Rep 蛋白对复制具有双 向调控作用, 且视它的胞 内浓度而定, 当胞内浓度 低时起复制激活剂作用, 胞内浓度高时则起抑制 剂作用。
分离(segregation)机制有关，不能在同一细胞中并 存的质粒是因为他们共享一个或多个共同的复制因 子或相同的分配系统。(对于单拷贝质粒???)
当两种复制及调控机制毫不相干的质粒在同一个细 胞中生存时,它们各自复制,再各自分配到不同的子细 胞中,不会发生干扰。当两种复制及调控机制相关或 相同的质粒在同一个细胞中生存时,质粒复制及调控 机制就会把它们看做成同种质粒而将他们的拷贝数 控制在一定的数目内。由于细胞时质粒在子细胞中 分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后,就会造 成敏感质粒的分离丢失。
严紧型质粒 (Stringent plasmid)
松弛型质粒 (Relaxed plasmid)
拷贝数 分子量
少 (1 ～ 3 个拷贝数) 较大
多 (10 ～ 60 个拷贝数) 较小
复制方式
随细菌染色体的复制同步进行， 独立于细菌染色体而自主复制, 即只在细胞周期的一定阶段进 即在整个细胞周期中随时可以 行复制，当细胞染色体复制一 复制，当染色体复制已经停止
质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。 彼此不相容的质粒 属于同一个不亲和群(incompatiblity group)。而彼此能够共 存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。不亲和群之间的质 粒是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。
质粒不相容性的原因 质粒的不相容性现象主要是与质粒的复制调控和
在随后的细胞生长期间, 这种质粒 对也逐渐分离, 使各质粒分子的复 制起始潜力得以恢复。
⒉ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation)
在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复 制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。
反义RNA : 小RNA 分子, 长35～150 nt, 有1～4个茎-环 ( stem-loop) , 其序列与靶转录物 5' 端的一个区域互补, 又 称反转录RNA( countertranscribed RNA, ctRNA)
质粒复制的调控机制
07制性 质粒复制的调控机制 质粒不相容性(inc, incompatibility)
质粒(plasmid)
质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的 一类核酸分子
绝大多数的质粒是DNA型 目前已知只有酵母杀伤质粒(killer plasmid)是RNA型
质粒不相容性 ( plasmid incompatibility ) 指在没有选择压力的情况下，同种的或亲缘关系相近的
两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象，也称为不 亲和性(inc)。例如colE1衍生质粒，它们之间是互不相容的， 也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一 细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释) 掉。
为Rep A的mRNA 。此外在
RNA-CX 5’ 端还编码Cop B
蛋白,可抑制PA开始的转录。
翻译水平调控: CopA可同 RepA的mRNA 5’ 端部分碱 基序列互补结合,产生位阻效 应阻碍了前导肽基因(tap) 的 翻译, 进而抑制了RepA 的合 成(翻译偶联), 影响质粒复制
四 质粒不相容性
负调控模型 质粒刚移入新宿主时,负调节因子的浓度可忽略不计,
质粒能在短时间内达到正常拷贝数, 然后通过增加或减少 每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝 数(N), 使该菌群中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值(Nav ) 附近的一个很小的波动范围内。
上述控制机制是由质粒自编码的负控制系统通过调控 复制起始率而实现的, 其负控制元件就编码在质粒上。
“手铐”模型 ( “handcuffing”model)
空间位阻模型
空间位阻模型认为, 决定质粒复制 率的主要因素是重复子的浓度而 不是Rep 蛋白的表达水平。当质 粒拷贝数较低时, Rep蛋白与重复 子结合并饱和, 促发复制起始; 随 着质粒拷贝数的增加, 结合于某一 起点重复子的Rep 分子, 开始与结 合于另一起点重复子的Rep 分子 相互作用, 并通过Rep- Rep 相互 作用把2个环状质粒分子偶联起来, 形成“手铐”状的复合物, 导致这 2个重复子区域之间出现空间位阻 而阻断复制的起始。
•知识回顾 Knowledge Review
•祝您成功
⑵ 抑制前导肽翻译
这种作用方式的例子是质粒R1, 它的基本复制子含有可读 框copB、tap 和repA, 分别编码转录阻遏蛋白CopB、前导 肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻译偶联的。 RepA蛋白是复制的限速因子, 以顺式作用, 但不能重复使 用, 其复制控制在转录和翻译两个水平上进行。主控制元 件是RNAⅠ,名为CopA,从repA-mRNA 前导区的一段互补 链转录而来, 长约90 nt。
绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结 构，即cccDNA (covalently close circular DNA )
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
一 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋 予宿主细胞特定的遗传性状.
质粒DNA的复制方式: 主要有“θ”型复制和滚环复制 根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制
INC 的分子生物学基础是质粒的复制调控机制存 在同源性,此外具有相同复制起始位点和分配区的 两种质粒也不能共存于同一个宿主菌
影响INC的主要因素: ⑴ 反义RNA编码区(主要决定区) ⑵ 重复子 ⑶ 复制起始位点 ⑷ 质粒分离机制(segregation system)
Thank you for your attention
次时质粒也只复制一次 时，该质粒仍然能够继续复制。
控制系统 常见质粒
单拷贝控制系统 F质粒, P1质粒
多拷贝控制系统
Col E1质粒(20～30) ; pBR322 (16 copies); pUC (30～50 copies)
二 质粒复制的调控机制
为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控 制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中, 某一质粒的拷贝数(N) 通常是一定的。
类型：
① 严紧型质粒(Stringent plasmid) ② 松弛型质粒(Relaxed plasmid) 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的， 同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型， 这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主 的控制，同宿主的状况有关。
质粒复制类型
⒈ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
在含重复子的质粒复制起点(ori) 中, 有一富AT 区和多个重复 序列(重复子) , 质粒编码的复制起始蛋白Rep 能以有序的方 式与重复子序列结合, 起到控制质粒拷贝数的作用。
在上述模式中,Rep蛋白结合在复制起始区及其附近的重复序 列上,对复制起始起着正调节作用,同时对其自身的表达起负 调节作用。
反义RNA的作用方式主要有以下两种:
⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1质粒为例来说明)
⑵ 抑制前导肽翻译
(以R1质粒为例来说明)
⑴抑制引物RNA 加工
ColE1 质粒的复制起始由一长为700 nt 的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。 RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 经构象变化后, 与模板DNA在复制起始区附近 偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 产生 游离的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 从这个游离的3’ - OH开始DNA前 导链的合成。
现在已知的复制控制方式主要有三类: ⑴ 单一元件控制; ⑵ 主、辅元件控制; ⑶ 2 种控制元件协同作用。
依所用负控制元件的类型不同, 质粒复制的控制系统主要 有: ⑴ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation)
⑵ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation) ① 反义RNA单独控制 ② 反义RNA 与转录阻遏蛋白共同控制
Regulation of plasmid colE1 copy number by antisense RNA:
控制复制引物与模板的 结合
RNAⅠ的启动子是组成 型的, 故其数量与质粒拷 贝数成正比, 但不稳定。
在ColE1 中还有一个质 粒编码的控制元件Rom 蛋白(又称Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 结合蛋 白, 它能增强RNAⅠ与 RNAⅡ的相互作用, 稳定 RNAⅠ- RNAⅡ复合物, 因而能加强对复制的抑 制作用, 但在上述控制回 路中只起辅助作用。
Regulation of plasmid R1 copy number by antisense RNA:
控制复制起始因子(RepA)与 Ori结合,从而抑制其上游 DnaA蛋白的结合,抑制复制 起始
转录水平调控: 在rep A基因 上游有两个启动子, PO(组成 型)和PA(调节型),分别转录产 生RNA-CX和RNA-A,均可作