食品微生物检验的质量控制

内容
食品微生物检验质量控制概述
食品微生物检验的室内质量控制
食品微生物检验的室间质量控制
食品微生物检验质量控制概述
一、质量控制相关定义
质量控制：满足质量要求的操作技术和活动。
质量保证：为了满足实验室质量要求 ，制定相应的计划并实施所进行的一系列系统活动
质量手册：是描述质量系统元素的文件或文件的集合。
二、食品微生物检验质量控制概念
质量控制是食品微生物学实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。
三、食品微生物检验质量控制目的
食品微生物学的质量控制是保证食源性致病菌的培养、分离、鉴定及血清学试验等的准确性，避免因操作变化导致检验结果错误。
四、质量控制分类
分为室内质量控制和室间质量评价两个组成部分
室内质量控制：实验室内部采取的以对比分析、跟踪以及对实验室工作的连续性控制计划。
室间质量评价：通过互相校准和/或检验对实验室的操作和结果所进行的评价。
五、质量控制内容
室内质量控制
实验室内部 质量保证的核心和基础
室间质量评价
外部组织或机构 质量评价
食品微生物学检验 室内质量控制
室内质量控制
一、对检验人员的要求
二、操作手册
三、检测环境要求
四、设备/仪器要求
五、仪器设备的功能监测
六、培养基的质量控制
七、试剂、染色液及抗血清的质控
八、检验过程的质量控制
九、标准菌株的来源和保存
十、实验室安全防护

一、对检验人员的要求
相应岗位的人员，应具备相应的技术能力，相应的技术能力证明（证书及证件）。
微生物检验室应有相应技术能力的人负责室内的技术工作，并设立质量监督员。
一、对检验人员的要求
高度的主观判断力

个人的技能、经验
细菌学的专业水平
二、操作手册
各级人员的职责和权限
实验室安全措施
样品采集和处理指南
培养基和试剂的配制方法
….等等
三、检测环境要求-房屋要求
房屋要求：足够宽敞、通风、有良好的照明。
房屋内墙面及地等应采用易于清洁的材料。
房间的设置应根据工作内容加以分用，设立专用房间。



三、检测环境要求-环境设施要求
专用房间的温湿度控制与记录（样品存放室）
特殊环境的微生物指标控制与记录（无菌室等）
专用工作室的标准操作规程和定期的检测校准程序。（洁净室等）
特殊环境中的专用设施质量控制应符合有关要求（净化工作台）

三、检测环境要求
食品微生物学检验室要求布局合理，操作区域与办公区域分开。洗涤室、

培养室、消毒间、无菌室应分开。无菌室要设有套间或缓冲间。微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。
三、检测环境要求
微生物检验室应制定合理、完善的卫生管理制度，采用湿式保洁，定期对操作环境进行消毒。对废弃物，应投入指定的容器内，经无害化处理后方可排放，，以防某些病原微生物传播。


三、检测环境要求
需在无菌条件下工作的区域应以明确标识并能有效地控制、监测和记录。每天记录环境检测报告，并经常进行空气落菌实验：定期对无菌室进行室内环境消毒。

三、检测环境要求-环境设施的相关技术指标
净化室、净化工作区域、洁净环境按国家及部颁标准进行检测。
空气洁净度指标：


检测频率及检测方法。一次/月；空气细菌检测（沉降法）。

四、设备/仪器要求-总则
满足开展相关检测项目的要求。
制定相关设备/仪器的作业指导书。
设备/仪器需进行检定校准。
设备/仪器的运行状况记录。
维修后设备/仪器的再校准或检查，应具有完整的检查记录。

温度计
实验室必须要有工作温度计和参照温度计。
工作温度计：用于日常温度检查。
参照温度计：用于校正工作的温度计。
温度计运行检查：一般可采用一次/半年的运行检查。
日常检查、校准检查、运行检查等都应做好相应的记录。
培养箱、水浴箱和冰箱的温度控制
培养箱的温差要求，一般显示值与实测值相差不大于±1℃，箱体内各点温差（内部的温度均衡性）以及温度波动同样不大于±1℃。
温度监控方法：可将工作温度计置甘油中，放入待测箱体内，观察工作温度计的温度，最好1-2次/天监控并记录。

高压灭菌锅的温度控制（一）
高压灭菌锅；可用生物指示菌法（常用）、化学变色纸片及高压灭菌锅温度计等方法进行检测。
生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果显示法。
高压灭菌锅由专人操作，并做好作业记录。
高压灭菌锅使用时，内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多。
高压灭菌锅的温度控制（二）

高压灭菌锅温度波动范围：110，115和121±2℃。
高压灭菌锅校准周期一般在半年。
干燥灭菌箱温度控制
干燥灭菌箱的温度校准：用参考温度计进行温度测试。
干燥灭菌箱温度要求与精确度：160±5 ℃或180 ±5 ℃。
干燥灭菌箱校准周期一般为一年。
培养基配制用蒸馏水的控制
按设备说明，定期清洁离子交换器和更换离子交换材料。
检测要求：西欧标准为微生物检验用蒸馏水的特定电导率＜0.5ms/m；细菌数＜50cfu/ml。我们日常用的标准

为 ＜10ms/m。
检测频率：1次/每月。
蒸馏水定点供应，并做好相应的质量控制及记录。
天平的管理
天平放置要求：无振动、无气流影响及水平台面上。
天平要有使用记录。
天平作为计量仪器是列入国家强制检定的范围，一般1次/年进行检定。

容积的控制（一）
保证高压灭菌后的稀释剂满足标准用量。
采取称中法来测定蒸发量，体积100ml的稀释剂起重量为101g。高压结束体积偏差不得超过1%。
采取先高压后定量分装，可避免因高压造成的体积误差。
对保存的定量液体应在使用时，注意补充容积。

容积的控制（二）
吸管的控制：通过小计量容器校准后使用。
小计量容器吸管、容量瓶、量筒等玻璃器皿，校准周期一般为1-2次/一年。
小计量容器日常使用检查可每周进行一次，包括容器的完整性，并做好相应的记录。

pH计
pH计使用前应用标准液进行校准。
缓冲液使用有效期：PH4.00 约1年
PH7.00 约6个月
pH9.00 约6个月
pH计的维护：电极外表的定期清洗；
电极敏感性检测及极性恢复。
净化工作台的控制
水平流净化工作台工作区域，要求洁净度为100级。空气沉降30min，细菌数＜1个/皿。垂直流净化工作台，细菌数＜0.49个/皿.
净化工作台运行检查频次：1次/月，采用细菌沉降检测。
净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次，并同时进行粒子与细菌沉降检测。

紫外线灯的控制
检测方法：仪器测试法和生物测试法。
前者是通过专用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强度。国家消毒技术规范中表明在距离照射源1米处，要求其强度为90 lx。
生物测试法：采用一定的菌培养物，经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml，涂布平板在紫外灯光下照射2min，同时设置普通光源的对照组，置37℃培养48h，计算其杀灭率，要求杀灭率达99%。
显微镜的控制
显微镜应有作业指导书，日常维护记录及自校记录。
显微镜应置于无振动、避免灰尘、防潮等要求的环境。

其它微生物检测专用仪器的控制
细菌鉴定仪、酶标仪等设备，工作中常用阳性对照检测其功能的正常性。
仪器的检定则按检定或自校作业指导书进行。
仪器的使用登记、校准计划、校准记录等文件存档。
仪器专人使用，操作者应持证上岗。
五、仪器设备的功能监测
高压灭菌器：定期监测（每月一次）
生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌
化学指示剂：变色的指示带
培养箱、冰箱、水浴箱：
每日早、晚两次温度观测，绘制温度曲线图
五、仪器设备的功能监测
厌氧培养装置：
化学标记： 美蓝
生物学指标：铜绿假单胞菌

CO2培养箱

：
每天检查箱内的CO2含量
五、仪器设备的功能监测
生物安全柜：
定期更换滤网，紫外线每3月检查1次

微生物鉴定仪
及时更新软件
每批号鉴定卡用标准菌株测定
五、仪器设备的功能监测


六、培养基质量控制
培养基的有效性试验
每一批新制或新购的培养基，使用前均须取标准菌株试验.
培养基的试验结果需要加以记录，项目包括试验日期、试验结果以及实验者的签名等。
培养基质量控制
培养基的量：
平板培养基的厚度一般为3mm
(90mm平皿+15-20ml培养基）
斜面不超过试管的2/3

常用培养基的质量控制 （一）
检验项目与方法：物理、化学及生物学指标鉴定
A：感官测定，检查其颜色与透明度，培养基应澄清，无浑浊。
B：PH测定，按各种培养基要求的PH±0.2。
C：生物学指标检定，无菌实验、被检培养基相应细菌生长率测试；菌落大小及特征的检测。

常用培养基的质量控制 （一）
无菌试验：
每批配好的培养基须进行无菌试验
随机选取5%-10%的量，如果配制大量的培养基，则任意选取10个平板或管装培养基，35℃温度下过夜培养，证明无菌生长为合格
常用培养基的质量控制 （二）
生长率测试：适用于液体和固体培养基：将菌培养液，用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度进行平板计数，同时以新鲜配制的国标培养基进行对照。

常用培养基的质量控制 （三）
菌落大小测试：划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制的国标培养基无统计学差异。

常用培养基检定用标准菌株
常用培养基检定用标准菌株
培养基保存环境
制成的培养基保存环境为4℃冰箱，如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存，
干燥培养基干粉含有活性物质或遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2-8 ℃条件保存。
含有高浓度胆盐的培养基存放于10-15 ℃。
培养基配制的质量控制
培养基的制作过程必须统一
培养基或添加剂的剂量、pH值、高温灭菌的时间或温度，都需遵照规定
培养基名称、本批配制量、配方、配制日期和配制人员姓名都必须详细记录

培养基制备控制程序
培养基配制所用的仪器设备必须经过相应的鉴定 。
配制培养基所用的用具及容器必须是清洁或是灭菌的。

培养基的配制程序（一）
不同的培养基配制时注意各类成分的用途。
对于干燥培养基配制，同样需要进行PH测验。


培养基的配制程序（二）
配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放。因为培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸，从而影响细菌的生长。
培养基中

的抑制剂及指示剂一定要精确称量。

七、试剂、染色液及抗血清的质控
染色液的质量控制
染色液要标明配制或购入日期，选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照鉴定。
革兰氏染色用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌制备浓菌悬液进行质量控制，每次质控与标本检测同步进行。
七、试剂、染色液及抗血清的质控
各种染色液的监控菌株

染色液 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度
革兰染色液 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 每天
抗酸染色液 结核分枝杆菌 每次
异染颗粒染色液 白喉棒状杆菌 每次
荚膜染色液 肺炎克雷伯菌 每批
鞭毛染色液 普通变形杆菌 福氏志贺菌 每次
七、试剂、染色液及抗血清的质控
试剂的质量控制
各类试剂，在配制或购入后均应进行“有效”试验，用已知阳性及阴性菌株进行试验
试剂须根据标示配制，适当储存
对较稳定的试剂如靛基质试剂应在配制时及每周予以检测，凡不稳定的试剂每天使用时均应检测，合格后才能使用
七、试剂、染色液及抗血清的质控


七、试剂、染色液及抗血清的质控
诊断血清的质量控制
购入的沙门菌属、志贺菌属、致病性大肠杆菌的诊断血清必须立即记录其购入日期、观察透明度、色彩有无变化和是否有沉淀物，然后置4℃冰箱保存
使用前应注意检查诊断血清的批号、有效期，如发现浑浊或有絮状沉淀物时，很可能系污染所致，不能再继续使用

七、试剂、染色液及抗血清的质控
诊断血清的质量控制
使用前应以阳性及阴性菌株进行检测，观察其效价及特异性
不得将诊断血清置室温保存,各种诊断血清均应置冰箱中4℃保存
每月用标准菌株进行一次测定

八、检验过程的质量控制
检测质量保证
定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制。
参加实验室间的比对或能力验证
利用相同或不同方法进行重复检测
对留存的样品进行再检测。

重复计数要求
菌落计数精密度控制直接计数，选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数。
自身同一平皿重复计数误差应小于7.7%
实验人员之间同一平皿重复计数误差±18 .2%
自身同一梯度平行加样两皿间相对误差小于7.7%
实验人员之间同一梯度计数误差±18 .2%
不同梯度间菌落计数最终误差小于7.7%

菌种鉴定质控
菌种鉴定质控要求，对所给的微生物菌种，按有关的方法及指标进行生化、血清等方面的鉴定。
鉴定质量评价：鉴定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练，结果报告是否正确。

内部质量控制的推荐频率
菌落计数精密度控制： 1次/3月；

菌种鉴定控制： 1次/半年或1年

九、标准菌株的来源和保存
标准菌株要求
必须是形态、染色反应、生理生化及血清学特性典型而稳定的菌株
实验结果重复性好，极少发生变异
国际社会认可
来源于专门机构
九、标准菌株的来源和保存
标准菌株来源
美国典型菌种保藏中心ATCC
卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中心
国家医学微生物菌种保藏中心
九、标准菌株的来源和保存
标准菌株的保存方法
冷冻干燥法：
最理想的保存方法，不改变菌种性状，保存时间长
手续繁琐，需专门的冷冻干燥设备
菌种保存中心均采用此法
九、标准菌株的来源和保存
标准菌株的保存方法
冰冻保存法：
此法较简单，将细菌混悬于脱纤维羊血或脱脂牛奶中，置液氮或-20℃冰箱保存
但细菌经多次转种，性状可能发生变异
九、标准菌株的来源和保存
标准菌株的保存方法
培养基保存法：最简易方便的方法，适用于大多数实验室
（1）普通琼脂斜面保存法：适于一般细菌的保存，置4℃冰箱可保存1个月。
（2）血琼脂斜面保存法：适于链球菌，可半月转种一次。
（3）半固体穿刺法：穿刺培养基并加液体石蜡，置4℃冰箱可保存3-6个月，适用于肠杆菌科细菌。
九、标准菌株的来源和保存
食品微生物检验实验室必备质控菌株：
大肠埃希菌 ATCC25922
大肠埃希菌 ATCC35218
铜绿假单胞菌 ATCC27853
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
粪肠球菌 ATCC29212
十、实验室安全防护
培训与告之
警示标志
防止空气污染
有毒有害物防护
消除污染和废物的处理


食品微生物学检验 室间质量评价
室间质量评价
室间质量评价是质量保证体系的重要组成部分。
实验室应参加外部的质量控制活动，对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。
室间质量评价
室间质量控制的一般性检查项目
1、仪器设备的操作书，使用、保养、维修记录。
2、培养基和试剂的配制记录、培养基的保存方法、灭菌质 量、有效期。
3、室内全面质量控制的建立，工作人员熟练程度的考核和盲样试验的进行情况，检验操作手册及操作规范性
室间质量评价
熟练程度的考核
用模拟食品标本做质量评价是目前国内外广泛采用的方法，主要评价实验室在病原菌的分离、鉴定试验等方面的工作情况。
室间质量评价
熟练程度的考核
由质控管理机构发放模拟标本或菌种，实验室按照日常的操作方法进行相应的分离鉴定试验。实验室完成鉴定后在规定时间内将结果反馈至参考实验室，进行评价。
室间质量评价
质控结果的分析与评价
质控管理机构对

每次质控结果进行统计分析，将每一实验室的结果与标准进行比较和统计分析，发回评估报告。