高效液相色谱分析

+
= 离子色谱分析
离子性成分的检测
离子色谱法用离子交换树酯为固定相，电解质溶液为流动 相，通常以电导检测器为通用检测器的色谱方法；
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固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离 子交换树脂分为三种形式：
1. 一是常见的纯离子交换树脂； 2. 第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表
正相色谱
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺 序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80 ％的顺、反 和邻位、对位异构体仍然要用正相 色谱来进行分离
• 在正相色谱柱中，极性弱的先流出
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反相色谱
1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：
• 液相色谱的柱外效应比气相色谱严重和显 著；
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液相色谱分离模式
一、吸附色谱（adsorption chromatography） 原理：
基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各 组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保 留和实现分离的方法。
固定相：
固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙 烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液 固吸附色谱。活性硅胶最常用。
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液液分配色谱流动相的选择原则
①样品易溶，且溶解度尽可能大 ②化学性质稳定，不损坏柱子 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收 ④粘度低，流动性好 ⑤易于从其中回收样品 ⑥无毒或低毒，易于操作 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯 ⑧废液易处理，不污染环境
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离子排斥色谱法
Ion Exclusion Chromatography
• 分离机理主要源于Donnan膜平衡、体积排阻和分 配过程。
• 固定相是具有较高交换容量的全磺化交联聚苯乙 烯阳离子交换树脂，这种阳离子交换树脂一般不 能用于阳离子的离子交换色谱分离。
• 离子排斥色谱对于从强酸中分离弱酸以及弱酸的 相互分离是非常有用的。如果选择适当的检测方 法，离子排斥色谱还可以用于氨基酸、醛及醇的 分析。
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应用
1. 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍 是最有效的方法，如农药异构体分离、石 油中烷、烯、芳烃的分离。
2. 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象
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二、液液分配色谱
• 原理 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度 不同（分配作用）而在两相中进行不同分配实现 分离的液相色谱分离模式
• 和GC的差异 相同的是：分离的顺序均取决于分配系数，分配 系数大的组分保留值大；不同之处是流动相的性 质对GC的分配系数影响不大，但对LC的影响很 大。
一般分为：液液色谱、键合相（bonded-phase）色谱
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液液分配色谱
1. 液-液分配色谱固定相：是通过物理吸附 的方法将固定液涂在载体表面，由于流动 相的溶解作用或机械力作用，固定相容易 流失，导致保留行为的改变，重现性很 差，引起分离试样的污染；
2. 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子 是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团 的有机分子
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液液分配色谱类型
• 正相色谱法HPLC（normal phase HPLC）：
流动相极性小于固定相极性的称为正相色谱，极性小的组分先流出，极 性大的组分后流出； 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代 表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附 色谱也属正相HPLC，适合于分离极性化合物
Mg2+ Ca2+
Column : IonPac CS12A, CG12A Eluent : 20 mM Methanesulfonic
acid Flow rate : 1.0 mL/min Detection : Conductivity
（CSRS Recycle mode)
2 4 6 8 10 12 14 Retention time (min)
5mM TBAOH／ 50mM H3BO3 Detection ： Conductivity
5
1. Formic acid
2. Acetic acid
3. Propionic acid
4. Butyric acid
5. Valeric acid
10
20
Retention time (min)
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• 无机阴离子: 酸根阴离子 • 无机阳离子: 碱金属,碱土金属,过渡金属 • 有机阴离子: 有机酸,烷基磺酸,多聚磷酸 • 有机阳离子: 有机胺,生物碱,吡啶 • 天然有机物: 糖,醇,酚,水溶性维生素 • 生物物质: 有机磷化合物,核酸,核苷酸,碱基,
蛋白质
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四、离子色谱法
离子性成分在色谱 固定相中的分离
以离子交换树酯为固定相，以及离子对交换剂具有不同的 亲和力而得以分离的色谱方法称为离子交换色谱法。
SO3H + M+
SO3M + H+
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阴离子分析实例
Column： IonPac AG12A /
AS12A
Eluent： 2.7mM Na2CO3
0.3mM NaHCO3
8
Flow rate： 1.2mL/min
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5 µS
0 0
离子排斥色谱分离实例
3
2 4
1
Column ： IonPac ICE AS1 Eluent ： 0.4 mM Octonesulfonic acid Flow rate ： 1.0 mL/min Suppressor ： AMMS-ICEⅡ Regenerator liquid ：
十八烷基或八烷基键合硅胶。离子对色谱基本上 可以采用通常的反相HPLC的分离体系。
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反相离子对色谱分离实例
Column :IonPac NS1、NG1
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吸附色谱
1. 流动相：
弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物， 如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲 醇、乙酸乙酯/乙腈等
2. 流动相的选择原则是：
极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用弱 极性的流动相。
3. 混合流动相：
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种 不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配 比k值范围很广则使用梯度洗脱
面层离子交换树脂； 3. 第三种为大孔径网络型树脂
按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树 脂和阴离子交换树脂
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流动相
离子交换树脂的流动相最常使 用水缓冲溶液，有时也使用有 机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲 溶液混合使用，以提高特殊的 选择性，并改善样品的溶解度
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离子色谱仪器构成
Eluent
Column
Sample injection valve
Pump
Detection cell Suppressor
F- Cl-
NO2-
Br- NO3-
SO42-
HPO42-
Detector
Pumping Injection
Separation
Detection
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• 反相HPLC（reversed phase HPLC）：
当流动相的极性大于固定相的极性的称为反相色谱，极性大的先流出， 极性小的后流出； 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系 正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的 流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，适合于分离 非极性或中等极性物质如：芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物
2. C18有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类 型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化 学分析工作中应用最为广泛。
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按键合到载体上的官能团可分为：
1. 非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分 子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用 的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱、C8、C4等
分体系；也难以分离分析分子 量相近物质； – 适合测定高分子物质的分子 量；
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离子色谱分类
按离子在固定相中的保留机理分类
• 离子色谱法 • 离子交换色谱 • 离子排斥色谱 • 离子对反相分配色谱 • 离子抑制色谱 • 金属配合物分配色谱
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离子色谱可以分离的物质
• 液固吸附色谱法中最常用的吸附剂是硅胶，流动 相是以烷烃为基的二元或多元溶剂系统；
• 适合分离相对分子量中等的油溶性样品，对具有 不同官能团的化合物和异构体具有较高的选择 性；
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三、空间排斥色谱 （又称凝胶色谱和分子筛色谱）
原理：不是按被分离物质在两相中的作用力 大小来进行分离，而是按分子尺寸与凝胶孔 径大小之间的相对关系来分离的的一种液相 色谱分离模式。
仪器分析第10讲
高效液相色谱分析2
朱永法 清华大学化学系
2005.5.10
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主要内容
• 高效液相色谱分离原理 • 液液分配色谱 • 离子色谱原理； • 凝胶色谱原理
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峰展宽因素
• 柱前峰展宽 是指由进样及进样器到色谱柱连接管引起 的峰展宽。
• 柱后峰展宽 主要由检测器流通池体积以及连接管所引 起的展宽。
离子对色谱法
(Reversed Phase Ion Pair Chromatography)
• 在固定相上涂覆或流动相中加入与溶质离子带相 反电荷的离子对试剂，使之与溶质Baidu Nhomakorabea子形成中性 疏水化合物，从而分离离子型或可离子化的化合 物的方法称为离子对色谱法。
• 分离机理是：吸附与分配。 • 固定相则是普通HPLC体系中最常用的低极性的
H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”， 通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相
2. 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极 性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定 相结合，所以先被洗脱下来
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液固吸附色谱法
• 流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据吸附 作用的不同而进行分离的色谱方法称为液固吸附 色谱法；
FNO2-
Detection： Conductivity
μS
Cl-
NO3-
SO42-
Br-
HPO42-
(ASRS Recycle mode)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Retention time(min)
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阳离子分析实例
4
3 µS
2
1
0 0
K+ Na+ NH4+
Recording(Chromatogram)
eluent
Temporal course
色谱分离过程
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离子交换色谱
（ion exchange chromatography, IEC）
IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带 负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的 分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的 分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保 留时间长短不同，从而被相互分离。
2. 键合固定相：以化学键合的方法将功能分 子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去；
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键合固定相
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化 学键合相硅胶 ，优点是：
①硅胶的强度大； ②微粒硅胶的孔结构和表面积易人为控制 ③化学稳定性好
最常用的键合相键型是：硅烷化键合相，它 是硅胶与有机硅烷反应的产物 ；
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OH OH + C18H37SiCl3 OH
O O Si C18H37 O
1. 最常用的“万能柱” ——“C18柱”，简称“ODS” 柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料 （Octadecylsilyl，简称ODS）。在反相色谱中 发挥着极为重要的作用，可完成高效液相色谱 70～80％的分析任务。
大分子全排出VR = V0 小分子全进入VR = V0 + VS 中分子部分进入VR = V0 + KVS
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空间空间排斥色谱
• 凝胶过滤色谱：流动相为水 溶液的凝胶色谱；
• 凝胶渗透色谱：流动相为有 机溶剂的凝胶色谱；
• 特点：
– 色谱柱不存在失活问题； – 分离组分有限，难以分析多组